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第1章：携带TRAIL基因的重组腺病毒对T淋巴瘤细胞株的杀伤作用研究1.研究背景&目的非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkins lymphoma，NHL)为目前增长速度最快的恶性肿瘤，与西方国家相比，T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-hodgkinslymphoma,T-NHL)在中国、日本等亚洲人群中发病率较高，与B细胞性淋巴瘤(B-cell non-hodgkins lymphoma，B-NHL)相比，T-NHL的侵袭性更强，尚缺乏统一的治疗标准，预后不佳。有必要寻找新的治疗药物和手段。有相当一部分的患者以结外局部发病为主，目前，对局部病灶的治疗手段包括放疗，电子线照射及氮芥外敷等，但这些治疗方法的副作用较大，疗效不佳。因此，亟需探寻新的局部治疗手段。
在肿瘤的局部治疗中，基因治疗是一种全新的治疗方法，目前已经应用于临床。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)作为外源性凋亡信号传导的重要启动因子，因能诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常组织和细胞没有毒性受到广泛关注。临床前研究提示其为一种非常有前途的抗癌药物，目前已经进入临床试验阶段。但TRAIL蛋白为系统给药，作用于病灶局部的浓度较低，且其体内半衰期过短，亦有多种肿瘤细胞株呈现出对TRAIL的耐药，因此发现一个新的治疗策略以克服TRAIL蛋白的药代动力学的缺点并克服其耐药有着很大的临床应用价值。
利用基因载体介导TRAIL基因在瘤体内得到持续而稳定的表达可以克服TRAIL蛋白的缺点，大大的改善治疗效果。我们之前的和其他的研究结果也表明，通过用腺病毒为载体，能很好地将TRAIL基因转染入多种肿瘤细胞表达膜连接的TRAIL而导致其凋亡，并因其产生膜连接的TRAIL有旁观者效应(bystander effect)从而明显增强TRAIL的抗肿瘤活性，而且可以逆转肿瘤细胞对TRAIL蛋白的耐药。携带TRAIL基因的重组腺病毒(Ad-TRAIL，AdT)已被证实对恶性黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞株有杀伤作用，显示出了强大的抗肿瘤活性，但尚未有作用于T淋巴瘤细胞株的报道。基于以上研究摹础，为了改善T-NHL的治疗效果，进一步探索T-NHL的局部治疗方法及扩大AdT的治疗范围，我们考虑研究AdT对T-NHL的体外抗肿瘤作用。
2.研究方法
人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株应用携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重组腺病毒载体(Ad-GFP，AdG)处理，以荧光显微镜观察细胞绿色荧光的表达情况；并以流式细胞仪分析细胞的GFP表达率。以AdT处理Jurkat细胞后，RT-PCR检测不同时间TRAIL基因的表达情况；MTT法检测不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)下的细胞毒作用；台盼蓝染色计数法检测AdT作用不同时间细胞的生长状况；采用Propidium Iodide(PI)单染流式细胞仪检测凋亡。分别以MTT法和Propidium Iodide(PI)单染流式细胞仪检测AdT和化疗药物阿霉素(adriamycin，ADM)、依托泊苷(etoposide，VP-16)、长春新碱(vincristine，VCR)、地塞米松(dexamethasone，DXM)联合用药的细胞毒作用和细胞凋亡。
3.研究结果
3.1.腺病毒对Jurkat细胞的感染效率腺病毒可成功感染Jurkat细胞，病毒作用细胞48小时后于荧光显微镜下观察，MOI为50时开始看到GFP表达，表达量随着感染病毒量的增加而逐渐增强；流式细胞仪检测显示，MOI为200时细胞GFP的表达率为(67.2±3.5)％；MOI为400时细胞GFP的表达率为(81.5±4.7)％。
3.2. AdT感染细胞后TRAIL基因的表达病毒感染后目的基因TRAIL可有效表达，并持续至感染后7天左右。RT-PCR检测发现，AdT感染Jurkat细胞后，TRAIL基因的表达逐渐增高，第3大达到了高峰，随后表达逐渐下降，第7天只能检测到TRAIL基因微弱的表达。而AdG感染的肿瘤细胞没有出现TRAIL的目的条带。 3.3.AdT抑制Jurkat细胞的增殖AdT作用细胞后，可抑制Jurkat细胞的增殖。MTT检测显示，AdT对肿瘤细胞的增殖抑制呈剂量依赖关系，AdG感染细胞后，并没有明显抑制Jurkat细胞的增殖；台盼蓝染色直接计数法显示AdT感染细胞后对细胞的抑制作用随时间延长而增加。
3.4.AdT诱导Jurkat细胞的凋亡PI染色流式细胞仪检测发现，AdT可诱导淋巴瘤细胞的凋亡，且随着剂量增加，诱导凋亡作用增强。AdG感染细胞72小时后，与细胞对照组相比，凋亡率未见明显增加。
3.5.AdT和化疗药物的联合作用MTT和PI染色流式细胞仪检测发现，AdT和DXM联合对Jurkat细胞的增殖抑制和诱导凋亡起协同作用，AdT和ADM、VP-16、VCR联合对细胞的增殖抑制为单纯相加作用。
4.结论
1.腺病毒载体可以成功转染T淋巴瘤Jurkat细胞株，并能持续有效地表达目的基因。
2. AdT感染Jurkat细胞后对细胞株有增殖抑制作用，并呈剂量和时间依赖性。
3. AdT主要通过诱导Jurkat细胞凋亡而抑制增殖。
4.AdT与DXM联合对Jurkat细胞的增殖抑制和诱导凋亡可能有协同作用。
5.AdT和ADM、VP-16、VCR联用对Jurkat细胞的增殖抑制为单纯相加作用。
第2章：套细胞淋巴瘤临床预后分析1.研究背景&目的套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma，NHL)的一种少见亚型，诊断时多为晚期(AnnArbor分期Ⅲ～Ⅳ期)，采用目前的标准治疗方法不可治愈。初治时虽然对治疗反应敏感，但缓解期短，复发率较高，复发后疾病更具侵袭性且对治疗反应变差，缓解期明显缩短。MCL的中位牛存期仅3～4年，属于NHL中预后最差的亚型之一。目前国内尚无大宗病例的报道。本研究的目的在于探讨中国人MCL的临床病理特征，诊治方法和影响预后的因素。 2.研究方法回顾性分析2000年到2007年中山大学肿瘤防治中心和南方医院收治的45例MCL患者。收集其临床资料如年龄、分期、PS、国际预后指数评分等和治疗效果、生存情况，采用Kaplan-meier法进行生存分析，采用Log-rank检验和COX部分风险模型进行预后因素分析。
3.研究结果
全组患者中位年龄56岁(23～76岁)；男女之比为3.5:1；33例患者(73.3％)以全身淋巴结肿大为首发症状；初诊时，27例(60.0％)有结外侵犯，37例(82.2％)为晚期病例(Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期)；26例(57.8％)患者国际预后指数大于1分。仅有16例(35.6％)患者在初次病理诊断时能够明确分型，29例患者被误诊为其他亚型。43例患者接受联合化疗，总反应率为76.7％，接受CHOP方案或类似方案化疗的患者总反应率和完全缓解率分别为73.3％和30.0％；接受R-CHOP或类似方案化疗的患者总反应率和完全缓解率分别为81.8％和72.7％。中位随访时间38个月，全组患者的5年总生存率为17.3％，2年无病生存率为27.2％，3年无病生存率为0。中位无进展生存期20个月。CHOP组和R-CHOP组的总生存率及无病生存率无显著性差异。29例(64.4％)患者在随访过程中出现疾病复发或进展。本研究中，单因素分析显示，MCL的预后因素包括治疗前PS、LDH、B症状、骨髓侵犯、外周血侵犯。多因素分析结果显示，只有PS和骨髓侵犯为影响MCL总生存的独立预后因素。
4.结论
1）MCL病理形态多变，国内对其认识尚不充分，病理分型不易明确，需结合形态学、免疫组化表型以确诊。
2）目前初治患者多采用以CHOP或R-CHOP为丰的方案化疗，不能治愈，需寻求新的治疗方法。
3）PS和骨髓侵犯为影响MCL总生存的独立预后因素