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分枝是植物适应环境所表现出的复杂的发育性状,是种子植物顶芽和腋芽发育与扩展后的结果,它决定着植物的株型。而植物的株型往往是影响作物生物量和结实量的关键。通过研究植物分枝相关基因,并利用生物基因工程的技术改变植株的形态以获得更理想的株型,可以充分利用自然资源及提高产量,改善濒危物种资源逐年锐减的现状。青天葵（Herba Nervilia Plicatae）为兰科芋兰属多年生宿根草本植物毛唇芋兰[Nervilia fordii（Hance）Schltr.]的干燥全草或叶。临床上主要用于肺结核咳血、小儿疳积、小儿肺炎等疾病。由于其本身自然繁殖数量少,繁殖系数低,加上人们过度采挖,目前野生资源临近枯竭。青天葵同属植物广布芋兰（Nervilia aragoana Gaud.）的药效及化学成分与青天葵极相似,在民间常被当做青天葵用。不同于毛唇芋兰的一块茎一叶,广布芋兰多出现一块茎多叶或一叶多块茎的现象。LS基因即番茄LATERAL SUPPRESSOR,是最早被发现,也是目前了解最为深入的分枝基因。目前在拟南芥、水稻、菊花等植物中均已发现其同源基因能调控植物分枝（分蘖）的形成。课题组前期已经通过对毛唇芋兰转录组平台的数据挖掘及克隆获得毛唇芋兰分枝相关基因NfLS,及用同源克隆的方法获得广布芋兰分枝相关基因NaLS,生物信息学分析发现两者均归属于GRAS转录因子家族。本论文通过研究两种芋兰分枝发育基因LS在模式植物中的功能,观察两种芋兰的LS基因对于模式植物的生长发育的影响是否存在差异,逐步加深对毛唇芋兰及芋兰属植物分枝发育调控机制的了解,以期在生产实践中采用适宜的措施提高其产量,缓解当前青天葵资源濒危的现状。本论文主要研究内容及结果如下:（1）两种芋兰LS蛋白的亚细胞定位观察通过农杆菌注射烟草叶片法分别将携带pRI101-EGFP、pRI101-NaLS-EGFP和pRI101-NfLS-EGFP质粒的农杆菌菌液注射入烟草叶片后,采用激光共聚焦显微镜观察基因在烟草叶片瞬时表达情况;大量提取pRI101-EGFP、pRI101-NaLS-EGFP和pRI101-NfLS-EGFP质粒,通过PEG介导法转化烟草叶片原生质体,采用激光共聚焦显微镜观察NaLS和NfLS基因的亚细胞定位情况。结果:EGFP基因在烟草表皮细胞中的细胞核、细胞膜和细胞质大量表达,定位于细胞核、细胞膜和细胞质中;NaLS、NfLS基因在烟草表皮细胞的细胞核中分布,两者均主要定位于细胞核。说明两者在烟草表皮细胞的核中表达,具备转录因子的一般特性,行使一定的生物学功能。（2）两种芋兰LS蛋白转录激活活性及DNA结合功能分析利用NCBI的数据库序列信息查询及下载拟南芥的LAS序列（Genebank:NC003070.9）,设计引物克隆得到CDS编码区域。根据NaLS、NfLS、LAS基因CDS序列与载体pGBKT7、pGADT7多克隆位点上的酶切位点设计特异性引物,通过一步克隆法构建酵母重组表达载体pGBKT7-NaLS/NfLS/LAS、pGADT7-NaLS/NfLS/LAS;根据参考文献与GRAS家族转录因子结合的基序（AAAACTGAAAGGGAGA）及载体pHIS2的酶切位点设计特异性引物,将两引物变性和复性后通过一步克隆法构建到酵母载体pHIS2上,构建重组质粒pHIS2-SCL。将酵母重组表达载体pGBKT7-NaLS/NfLS/LAS分别转入酵母中表达并分析α-半乳糖苷酶活性;酵母重组表达载体pHIS2-SCL与pGADT7-NaLS/NfLS/LAS共转入酵母中表达,分析NaLS、NfLS、LAS蛋白与特定DNA序列结合情况。结果:NaLS、NfLS蛋白均未显示转录激活活性,LAS蛋白在酵母系统中具有转录激活活性;NaLS、NfLS和LAS均未检测到特异DNA结合活性,不能与基因调控特定DNA序列（AAAACTGAAAGGGAGA）结合。（3）两种芋兰LS基因在烟草与拟南芥中遗传转化及表达分析将携带pRI101-NaLS-EGFP、pRI101-NfLS-EGFP、pRI101-EGFP载体的农杆菌浸染烟草叶盘获得过表达再生烟草,分析植株中异源基因的表达量并观察表型。同时,通过浸花法转染拟南芥,进行抗性筛选与PCR验证阳性植株后,统计分析阳性植株表型,并用实时荧光定量PCR的方法分析LS基因在转基因拟南芥不同组织部位（莲座叶、茎生叶、茎、角果、根）中的表达量。通过模式植物遗传转化分析LS在模式植物中对分枝发育的影响作用。结果:成功获得了过表达再生烟草,分析了不同烟草植株的表达量,观察得到转基因对烟草的生长产生了一定的影响;成功获得了过表达两种芋兰属植物LS基因的拟南芥植株,通过对其表型分析统计发现,NaLS和NfLS两株系的总叶数、莲座叶一级和二级分枝数、植株高度等表型均有显著差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,NfLS在各部位中的表达高低顺序为莲座叶>茎>茎生叶>根>角果,与在原植物青天葵中的组织表达特异性基本相同,叶片表达量高于根茎和块茎。