丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起急、慢性肝炎的重要肝嗜性病毒之一。然而,目前对HCV感染慢性化和免疫逃逸的致病机理仍然缺乏全面深入的理解。要建立持续性感染,病毒必须调控参与细胞存活、生长、生物大分子合成和代谢的关键信号通路。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路即为这样的信号通路。已发现多种DNA病毒调控mTOR通路以促进持续性感染和致病。同时,凋亡作为维持细胞稳定性的重要生理机制,其功能失调常常见于持续性病毒感染。我们前期发表的结果表明HCV非结构蛋白5A (nonstructural protein 5A, NS5A)结合细胞蛋白FKBP38从而抑制细胞凋亡,但其机理不详。近期发现FKBP38为mTOR通路新成员,在营养或生长因子控制下,FKBP38结合并抑制mTOR激酶活性。为了进一步理解NS5A的生物学活性以及HCV持续性感染的致病机理,本实验研究了HCV NS5A对mTOR信号通路的调节及其对细胞存活的影响。在人肝癌细胞系Huh7中过表达HCV NS5A的结果表明,血清饥饿条件下NS5A以时间和剂量依赖方式增加mTOR下游靶点S6K1和4EBP1磷酸化水平。而在10%血清存在条件下,NS5A不能提高S6K1和4EBP1磷酸化水平。同样,在血清饥饿条件下,NS5A稳定表达的Huh7细胞(NS5A-Huh7)和HCV亚基因组复制子细胞中,S6K1和4EBP1磷酸化水平明显高于对照细胞(neo-Huh7)。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素(rapamycin)或NS5A特异性的siRNA (siNS5A)可阻断NS5A对S6K1和4EBP1的磷酸化作用,提示NS5A特异性的活化mTOR信号通路。但是,在NS5A-Huh7细胞中,PI3K特异性抑制剂LY294002不能阻断NS5A对S6K1和4EBP1的磷酸化作用,表明NS5A活化mTOR通路不依赖于其上游组分PI3K。进一步运用NS5A突变体(NS5A-AI,不与FKBP38结合)、FKBP38突变体(FKBP38-Δ3×TPR,不与NS5A结合)以及FKBP38特异性siRNA (siFKBP38)研究发现,NS5A对mTOR通路的活化作用依赖于NS5A与FKBP38的结合。为了探索NS5A活化mTOR信号通路的机制,我们考察了NS5A、FKBP38、mTOR三者的结合情况。在过表达NS5A的Hela和Huh7细胞中,运用GST-pull down方法证明,在血清饥饿条件下,GST-FKBP38与mTOR的结合消失,而GST-FKBP38仍与NS5A结合。这些结果在NS5A-Huh7和HCV亚基因组复制子细胞中得到了一致的验证。更重要的是,在NS5A-Huh7和HCV亚基因组复制子细胞中,GST-FKBP38-Δ3×TPR可回复性结合mTOR。这些结果提示NS5A可破坏FKBP38与：mTOR的结合。与GST-pull down结果相同,在同时过表达FKBP38与NS5A的Huh7细胞中,免疫共沉淀实验表明,血清饥饿条件下FKBP38与mTOR的结合消失,FKBP38仍与NS5A结合。同时,有无血清并不影响NS5A-FKBP38的结合。单独过表达FKBP38且无血清存在时,FKBP38与mTOR结合,而有血清存在时两者结合消失。NS5A与mTOR之间不存在直接或间接结合。这些结果在neo-Huh7、NS5A-Huh7及HCV亚基因组复制子细胞中得到了进一步验证。另外,同时过表达NS5A-ΔI和FKBP38、或NS5A和FKBP38-Δ3×TPR时,可恢复mTOR与FKBP38的结合。共定位分析发现,血清饥饿条件下,NS5A-Huh7、HCV Replicon细胞中FKBP38与mTOR的共定位消失。这些结果提示NS5A是通过与mTOR竞争结合后者内源性抑制剂FKBP38,从而活化mTOR信号通路。以往研究表明mTOR信号通路活化可促进细胞存活。因此,我们进一步在无血清存在条件下利用凋亡诱导剂星孢菌素(stauroporine)考察了NS5A活化mTOR信号通路对细胞凋亡的影响。结果发现,无rapamycin预处理的NS5A-Huh7中,caspase3和PARP活化水平明显低于rapamycin预处理的NS5A-Huh7细胞、rapamycin处理或不处理的对照neo-Huh7细胞。Hoechst33342染色结果也表明,rapamycin未处理的NS5A-Huh7凋亡数量明显低于rapamycin处理的NS5A-Huh7细胞、以及rapamycin处理或不处理的对照neo-Huh7细胞。而且,NS5A特异性siRNA可明显恢复NS5A-Huh7细胞对staurosporine诱导凋亡的敏感性,表现为caspase3和PARP活化水平明显升高。这些结果提示NS5A通过mTOR信号通路特异性抑制细胞凋亡。进一步实验表明,同时过表达NS5A和FKBP38且无rapamycin预处理的Huh7细胞中,caspase3、PARP活化水平低于同时过表达NS5A和FKBP38-Δ3×TPR、或NS5A-ΔI和FKBP38且rapamycin预处理或不预处理的Huh7细胞。与此一致,用FKBP38特异性siRNA (siFKBP38)单独处理NS5A-Huh7、HCV亚基因组复制子细胞发现,其caspase3、PARP活化水平明显低于rapamycin联合siFKBP38处理或rapamycin单独处理的细胞。Hoechst33342染色也得到一致的结果。这些结果提示,NS5A通过mTOR信号通路抑制细胞凋亡依赖于NS5A-FKBP38结合。上述结果表明,HCV NS5A通过与mTOR竞争结合后者内源性抑制剂FKBP38,活化mTOR信号通路,从而抑制细胞凋亡、促进细胞存活。提示HCV编码的病毒蛋白可通过调控细胞关键信号通路,从而促进HCV持续性感染、参与HCV致病机制。