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血吸虫病（Schistosomiasis）是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病，也是我国当前防治的重点传染病之一。至2005年，全国有疫情未控制县（市、区，简称县）105个，疫情回升县38个，血吸虫病人79.8万，钉螺面积38.6亿平方米，且每年都有急性血吸虫病例发生，血吸虫病防治形势依然严峻，防治工作任重而道远。控制血吸虫病关键之一就是要及时和准确地发现病人，因此血吸虫病诊断在查病治病体系中始终处于中心位置。病原学检查是血吸虫病确诊的唯一手段，但其敏感性和依从性较低。免疫学诊断技术具有较高的敏感性和特异性，可弥补病原学检查不足，因此已逐渐整合到我国血吸虫病防治工作中。目前常用的血吸虫抗体检测技术的敏感性多在90％以上，但其特异性尚待提高，如与健康者假阳性率多在3％～5％之间，与并殖吸虫、华支睾吸虫、旋毛虫的交叉反应率分别在10％～17％、4％～10％和8％～13％之间。主要原因是血吸虫与其它寄生虫之间存在着相同或相似抗原表位。免疫诊断技术特异性的关键取决于抗原的纯度。目前常用血吸虫病诊断抗原多为虫卵或成虫粗制抗原，有成份复杂、交叉反应率偏高等缺陷。而成分抗原也存在制备过程复杂，抗原得量较少，似不具备推广价值。随着基因重组技术的快速发展和在血吸虫病免疫诊断中的应用，有可能为改善免疫诊断方法提供新手段。例如，可进一步提高诊断方法的特异性，制备的重组抗原易于标准化，并进入工业化批量生产的程序。因此，筛选并克隆表达极具诊断价值潜能的新型重组抗原作为特异性诊断抗原，对血吸虫病诊断工作具有很大的现实意义。日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白（SjcTrx）由106个氨基酸组成，分子量约为12kDa，在虫体内分布广，具有氧化还原调节功能和多种生物学活性，是血吸虫存活过程中的一个非常重要的生理分子。已有研究表明曼氏血吸虫Trx具有较好的免疫原性和免疫反应性，有可能成为理想的免疫诊断抗原。原核表达系统大肠杆菌中表达的蛋白缺乏翻译后的修饰和糖基化，其抗原活性较低。而毕氏酵母表达系统是近年发展起来的蛋白质真核表达系统，既有原核生物生长快、操作简单等特点，又有哺乳动物细胞表达系统翻译后加工和修饰的功能，分泌表达产物无过度糖基化且易于纯化，因此具有重要的潜在应用价值。为探讨SicTrx重组抗原作为日本血吸虫病特异性诊断抗原的可能性，本研究开展SjcTrx编码基因在毕氏酵母菌克隆和表达工作，并进行了免疫反应性的研究。首先，根据公布的日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物，上游引物引入EcoRⅠ酶切位点和起始密码子ATG，下游引物引入XbaⅠ酶切位点。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板，经反转录——聚合酶链反应（RT-PCR）扩增SjcTrx基因。双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的含有AOX1启动子pPICZαA质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pPICZαA-SjcTrx，转入至大肠杆菌Top10，获得高拷贝重组质粒。经限制性内切酶双酶切、PCR扩增和核苷酸序列鉴定正确后，用BstXⅠ酶单切重组质粒pPICZaA-SjcTrx使其线性化，并转化至感受态X-33毕氏酵母菌。用含有100μg／mlZeocin的YPDS平板筛选集落，经测序确认后用Pichia pastoris Easy SelectTM表达系统BMGY培养基培养，用甲醇诱导AOX1启动子表达产生可溶性重组SjcTrx蛋白。SDS-PAGE分析重组SjcTrx蛋白，Ni2+吸附组氨酸标记的亲和层析法纯化，Western blotting观察重组SjcTrx蛋白的免疫反应性。研究结果显示，SjcTrx编码基因RT-PCR扩增产物约335bp，分子量与预计大小一致。构建的pPICZαA-SjcTrx／TOP10重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳中均观察到相同大小基因片段，核苷酸序列测序证实SjcTrx基因序列与设计的序列完全一致，长度为318bp，开放阅读框架编码含有106个氨基酸，已登录到GenBank（DQ401029）。SjcTrx与日本血吸虫菲律宾株Trx和曼氏血吸虫TrxDNA序列同源性分别为98％（313／318）和70％（223／318），推导的氨基酸序列同源性分别为96％（102／106）和64％（68／106）。重组表达载体pPJCZαA-SjcTrx／X-33经限制性内切酶单酶切、PCR扩增和核苷酸序列测定均证实SjcTrx基因己整合于毕氏酵母菌染色体中。经SDS-PAGE分析，在BMGY培养液中甲醇诱导可表达出SjcTrx重组蛋白，分子量约为14kDa，48～72h蛋白表达量最高。经Ni2+吸附组氨酸标记的亲和层析法纯化蛋白后，Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染小鼠血清所识别，不被正常小鼠血清、斯氏狸殖吸虫感染大鼠血清、华支睾吸虫感染大鼠血清和旋毛虫感染小鼠血清所识别，表明SjcTrx重组抗原具有较好的免疫反应性和特异性。综上所述，SjcTrx编码基因在毕氏酵母菌的克隆和表达获得成功，SjcTrx重组蛋白具有较好的免疫反应性和特异性，有可能成为理想的特异性诊断抗原和血吸虫功能研究的工具分子。