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产甲烷菌是严格厌氧菌,利用传统微生物学研究方法对其进行研究费时费力,而近代发展起来的现代分子生物学技术,则避免了这些缺点和不足。现代分子生物学技术以其独特的优势在环境微生物的研究中发挥着越来越重要的作用。本实验改进了沼气池微生物总DNA的提取方法,经过检验,可满足本研究的需要。本研究通过对产甲烷菌特有mcrA基因的RFLP分析、mcrA基因的荧光定量分析以及16S rDNA的DGGE分析等分子生物学方法对农村户用沼气池中的产甲烷菌群落结构和数量进行了研究。首先扩增了沼气池中产甲烷菌甲基辅酶M还原酶α亚基(mcrA)基因片段,建立产甲烷菌mcrA基因文库,对阳性克隆用限制性内切酶PstⅠ进行RFLP分析,酶切后1、2、3、4号沼气池分别得到3、4、4、2种OTU(operational taxonomic unit),从每一类型OTU中选取1-2个单克隆测序后进行系统进化分析。结果表明,农村户用沼气池中存在不同的产甲烷菌类群,1号沼气池中主要有Methanogenium、Methanocorpusculum和Methanosarcina;2号池中有Methanogenium、Methanocorpusculum、Methanobacterium和未培养菌属;3号池中有Methanospirillum、Methanobacterium和未培养菌属;4号池中有Methanogenium和Methanobacterium。通过Touch-down PCR策略扩增产甲烷菌16S rDNA序列进行DGGE分析,结果表明,正常发酵产气的沼气池中存在不同的产甲烷菌类群,并不同程度的存在优势菌群。几个沼气池中均有甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)的分布,还存在着一些分类地位不明确的Uncultured euryarchaeote等菌属。DGGE分析与RFLP分析虽然都是扩增产甲烷菌特异的DNA序列,但对两者结果的比较分析方面来看mcrA基因片段似乎更能特异地用来分析产甲烷菌。本研究运用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)方法对各沼气池中存在的产甲烷菌的数量进行了研究。设计了扩增产甲烷菌mcrA基因的特异性引物对qMCR-F/qMCR-R,扩增后构建标准质粒并根据标准质粒构建标准曲线,根据标准曲线对沼气池中的产甲烷菌进行绝对定量。结果显示,各沼气池中产甲烷菌数量在105～108个/mL之间。