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目的:手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)的发病率在我国占丙类传染病中居首位,它是由肠道病毒感染引起,其中肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV 71)与多种疾病发生有关,也是引起儿童重症手足口病的主要病原体。前期我们在EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma,RD)的转录组测序结果中发现,活化白细胞黏附分子(ALCAM)基因水平变化明显。有研究显示ALCAM参与调控了细胞凋亡过程,但有关它在病毒感染过程中作用的研究较少。EV71对感染引起的细胞自噬及凋亡的调控对病毒复制有调控作用。因此,本实验旨在探究在EV71感染正常胃上皮细胞(human normal gastric epithelial cells,GES-1)中ALCAM分子水平是否发生变化,且该变化对EV71诱导的自噬与凋亡发挥何种作用,为进一步了解EV71的致病机制增加实验证据,也为EV71感染的预防与治疗提供新的思路。方法:1.建立EV71感染GES-1细胞模型。实验分为对照组(mock)和病毒干预组(不同剂量或时间)。通过Western blot检测EV71感染对GES-1细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白水平变化以及通过DAPI核染色检测EV71感染GES-1细胞后,细胞核发生的变化,判断细胞凋亡发生程度。同样实验分为对照组(mock)和病毒干预组(不同剂量或时间),通过Western blot、免疫荧光法检测EV71感染对GES-1细胞自噬相关蛋白LC3、p62蛋白水平变化,判断细胞自噬发生程度。选取EV71最佳感染时间与剂量用于后续实验。2.通过Western blot及免疫荧光法检测EV71感染GES-1细胞不同剂量或时间,ALCAM水平变化。3.构建真核表达载体pEGFP-ALCAM,通过酶切、测序,检测是否构建成功。4.质粒转染。实验组分为四组,分别为pEGFP-C1空载或对照siRNA转染组、pEGFP-C1空载或对照siRNA转染后进行病毒干预组、pEGFP-ALCAM或ALCAM siRNA转染组、pEGFP-ALCAM或ALCAM siRNA转染后进行病毒干预组。通过荧光显微镜、Western blot及RT-PCR检测转染效率。5.将上述方法4中实验组通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3、p62蛋白水平变化,以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白水平。观察过表达或敲低ALCAM对细胞自噬与凋亡影响。6.将上述方法4中实验组通过Western blot、RT-PCR以及TCID50检测,观察过表达或敲低ALCAM对病毒复制以及病毒释放的影响。7.统计分析数据以(?)表示,用GraphPadprism5.0软件进行统计分析,组间差异采用独立样本t检验,P<0.05定义为差异有统计学意义。结果:1.EV71感染诱导正常胃上皮细胞发生凋亡:免疫印迹结果显示随着EV71作用GES-1细胞时间和剂量的增加,凋亡相关蛋白Caspase-3逐渐发生活化,底物PARP逐渐发生降解;DAPI核染色结果显示EV71引起细胞明显减少,而且能够导致细胞发生变形,胞核皱缩成颗粒状荧光。2.EV71感染诱导正常胃上皮细胞发生自噬:免疫印迹结果显示随着EV71感染GES-1细胞时间和剂量的增加,LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转换增加,p62逐渐发生降解;免疫荧光结果显示病毒感染GES-1细胞24h后,与对照组细胞相比,FITC标记的LC3绿色荧光增强,TRITC标记的p62红色荧光减弱。3.EV71能够引起ALCAM蛋白表达的改变:通过免疫印迹与免疫荧光结果发现,EV71在低剂量与作用时间短的情况下,ALCAM蛋白表达增加,但高剂量与长时间作用下,ALCAM蛋白水平表达降低;用UV灭活病毒与活病毒进行比较,发现在活病毒干预下,ALCAM蛋白较少,但UV灭活病毒干预下,ALCAM变化不明显,说明是在病毒感染进入细胞后的过程中,导致ALCAM蛋白表达发生变化。4.成功构建真核表达载体pEGFP-ALCAM。5.ALCAM蛋白水平的改变对细胞凋亡、自噬及病毒复制的影响:ALCAM过表达能够抑制细胞凋亡与自噬,有利于病毒的复制;相反,敲低ALCAM能够促进细胞凋亡与自噬,抑制病毒复制,利于病毒的释放。结论:EV71感染GES-1细胞可诱导细胞凋亡和细胞自噬发生,自噬及凋亡的变化受ALCAM蛋白水平的调控,ALCAM能够抑制GES-1细胞发生自噬与凋亡,而且能够促进EV71在GES-1细胞内的复制。这些结果为我们更好理解EV71的致病机制提供实验基础,也为防治EV71感染提供新的线索与思路。