论文部分内容阅读
目的支气管上皮细胞通过分泌许多细胞因子及趋化因子,在哮喘气道慢性炎症和气道重塑中发挥重要作用。气道慢性炎症和气道重塑是哮喘显著性特征。目前哮喘的主要治疗药物为糖皮质激素和β2-受体激动剂等,但长期应用副作用大、敏感性下降,因此探索能够有效调节关键性细胞因子的活性,使细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积与降解趋于平衡的药物已经成为抗气道重塑研究的方向之一。地龙是有确切疗效的抗哮喘药物,其广泛的药理作用与哮喘气道重塑密切相关,本实验观察地龙对屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus,Der p1）抗原致敏人永生化支气管上皮细胞系BEP2D（Human epithelial cells,HBE）及人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast,HLF）影响,探讨地龙在支气管哮喘治疗中的价值及可能的作用机理,为临床治疗提供新的思路。方法给予人永生化支气管上皮细胞系BEP2D（HBE）以不同的干预和治疗,分为:单纯培养组即对照组（A组）,Derp1抗原（10μg/ml）组（B组）,Derp1抗原（10μg/ml）+地塞米松（Dexamethasone,DEX）(1×10-6mol/l)组（C组）,Derp1抗原（10μg/ml）+地龙注射液（0.9mg/ml）组（D组）,Derp1抗原（10μg/ml）+地龙注射液（9mg/ml）组（E组）,Derp1抗原（10μg/ml）+地龙注射液（18mg/ml）组（F组）,培养72小时,逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）实验检测各组细胞白细胞介素（IL）-13（Interleukin-13,IL-13）mRNA,转化生长因子（TGF）-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA,Smad2 mRNA表达;并收集以上各组上清液,作用于人胚肺成纤维细胞（HLF）72小时,免疫细胞化学法检测平滑肌肌动蛋白（SMA）-α（Smooth muscle actin-α,α-SMA）,纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）表达。数据分析采用SPSS13.0软件,计量数据以（?）±s表示,多组间比较用方差分析检验,多组间的两两比较用q检验,两数据的相关性比较用Spearman等级相关分析。结果1.Derp1对HBE细胞的形态学的影响:倒置相差显微镜下观察,正常组为未加Derp1抗原,表现为单层细胞完全平铺,HBE细胞在正常生长状态下以圆形或类圆形细胞占主要份额（如图1A箭头所示）,梭形细胞比例较少,体积较大,排列紧密;加入Derp1抗原（10μg/ml）组培养72h后,表现为细胞瘦长（如图1B箭头所示）,细胞间隙增大（如1三角符号所示）,即出现小孔。2.IL-13,TGF-β1,Smad2等细胞因子基因水平表达各组间差异有统计学意义（p＜0.01）,B组IL-13 mRNA,TGF-β1mRNA,Smad2mRNA表达高于A组,且差异有显著性（p＜0.05）,地龙各剂量组（D、E、F组）及C组IL-13 mRNA,TGF-β1mRNA,Smad2mRNA与A组存在一定差异,但差异无统计学意义（p＞0.05）;地龙各剂量组（D、E、F组）及C组IL-13mRNA,TGF-β1mRNA,Smad2mRNA表达受到抑制,与B组比较差异有显著性（p＜0.05）,D、E、F组与C组比较,差异无统计学意义。D、E、F组间虽有一定差异,但差异无统计学意义（p＞0.05）,即不存在明显的量效关系。3.α-SMA,FN蛋白表达A、B、C、D、E、F组上清液对应HLF组分别为A1、B1、C1、D1、E1、F1组。B1组α-SMA,FN表达高于A1组,且差异有统计学意义（p＜0.01）,E1、F1组及C1组α-SMA,FN表达与A1组存在一定差异,但差异无统计学意义（p＞0.05）;D1、E1、F1组及C1组α-SMA,FN表达受到抑制,与B1组比较差异有显著性（p＜0.01）,D1、E1、F1组与C1组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。4.各检测指标相关性分析TGF-β1mRNA与Smad2 mRNA呈正相关（rs=0.9429,p＜0.05）。TGF-β1mRNA与FN蛋白表达呈正相关（rs=0.9429,p＜0.05）。结论1.屋尘螨抗原可引起人支气管上皮细胞哮喘样改变,表现为IL-13,TGF-β1,Smad2等细胞因子表达增加。2.人支气管上皮细胞在诱导气道重塑中起重要作用,表现为屋尘螨抗原致敏人支气管上皮细胞后收集上清液,作用于成纤维细胞,可引起α-SMA,FN蛋白表达增加。α-SMA、FN两因子,可间接反映气道重塑的程度。3.地龙对哮喘气道重塑有抑制作用,其机制可能为通过抑制IL-13/TGF-β1,TGF-β1/Smad2信号通路,进而使成纤维细胞α-SMA,FN表达减少;并为哮喘治疗提供新的思路。