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研究目的与意义1.了解人、淡水鱼、蛙源香港海鸥菌分离株中产ESBLs菌株的分布情况及耐药性。2.研究产ESBLs香港海鸥菌携带的ESBLs基因型、常见耐药基因(磺胺类、四环素类、喹诺酮类等)和毒力基因及其分布特征。3.分析产ESBLs香港海鸥菌携带的整合子及质粒复制子,探讨产ESBLs香港海鸥菌耐药性传播和扩散特征。研究方法1.研究菌株共有112株香港海鸥菌,包括2株江门人源株,1株广州人源株,1株香港人源株,62株深圳蛙源株,46株深圳草鱼株。112株菌株中,109株菌由本实验室分离于2015年4月—2016年5月,2株分离于2009年10月,1株分离于2003年7月。所有菌株经一系列生化检测及16S rRNA特异性片段PCR检测后确认为香港海鸥菌。2.采用双纸片协同试验筛选产ESBLs香港海鸥菌,采用K-B药敏纸片法检测香港海鸥菌对临床常用的13类25种抗生素的耐药性。3.采用PCR扩增及DNA测序技术检测产ESBLs香港海鸥菌的ESBLs基因型、常见耐药基因(磺胺类、四环素类、喹诺酮类)、毒力基因、整合子及质粒复制子的分布情况。4.应用SPSS 20.0统计软件分析耐药表型、耐药基因、毒力基因、水平转移元件的分布差异及相关关系,两样本率的比较采用卡方检验或Fisher精确概率法,均进行双侧检验,检验水准α=0.05。研究结果1.本实验对来自腹泻病人、淡水鱼、蛙的肠道的112株香港海鸥菌的检测结果表明,91株(81.3%)为产ESBLs菌株,包括3株人源株,47株蛙源株,41株鱼源株。产ESBLs菌株耐药率普遍高于非产ESBLs菌株,对氨苄青霉素(33.0%vs 9.5%)、头孢唑啉(75.2%vs 38.1%)、头孢噻肟(85.7%vs 57.1%)、头孢曲松(87.9%vs 52.4%)、头孢西丁(50.5%vs 19.0%)、环丙沙星(18.7%vs 0%)和复方新诺明(29.7%vs 4.8%)的耐药率、多重耐药率(62.6%vs 38.1%)均显著高于非产ESBLs香港海鸥菌(P<0.05)。2.蛙源产ESBLs菌株对复方新诺明(57.4%vs 0.0%)、四环素(53.2%vs 0.0%)、环丙沙星(34.0%vs 2.4%)、左氧氟沙星(19.1%vs 0.0%)和链霉素(10.2%vs 0.0%)的耐药率及多重耐药率(72.3%vs 51.2%)显著高于鱼源产ESBLs菌株(p<0.05);且蛙源产ESBLs酶多重耐药菌株平均耐抗生素个数(5.44)高于鱼源产ESBLs多重耐药菌株(3.29);蛙源产ESBLs菌株多重耐药模式较鱼源、人源产 ESBLs 菌株更复杂,以CFP/CEP/CFZ/CTX/CAZ/CRO/FOX/RIF/TET/SXT为主,而鱼源产ESBLs菌株多重耐药模式以AMP/CFP/CEP/CFZ/CTX/CAZ/CRO/FOX/RIF为主,人源产ESBLs菌株以CFP/CEP/RIF/AMP/CAZ为主。3.产ESBLs香港海鸥菌主要ESBLs基因型别为CTX-M-9(90.1%)和TEM(75.8%)。单菌株可同时携带1-3种型别ESBLs酶,其中以同时携带CTX-M-9和TEM最为多见(64.8%)。产ESBLs菌株同时携带多种其他类别的耐药基因,如磺胺类耐药基因sull(33.0%)、sul2(20.9%),四环素耐药基因tetA(25.3%)、tetR(26.4%),以及喹诺酮耐药基因 aac(6’)-Ib-cr(9.9%)。产ESBLs菌株还同时携带多种与黏附(fimH、bfpA和eaeA)、铁吸收(ireA和iucD)、细胞毒素(hlyA)、膜蛋白(traT和iss)(检出率分别为100%、28.6%、1.1%、23.1%、7.7%、2.2%、92.3%和42.9%)等相关的毒力基因。4.蛙源产ESBLs菌株磺胺类耐药基因sull、sul2,四环素耐药基因tetA、tetR,以及喹诺酮耐药基因aac(6’)-Ib-cr检出率(分别为55.3%、40.4%、40.4%、42.6%、17.0%)均显著高于鱼源产ESBLs菌株(分别为9.8%、0.0%、9.8%、9.8%、2.4%)(P<0.05)。此外,蛙源产ESBLs菌株平均携带毒力基因个数(3.40)高于鱼源株(3.02),其中bfpA(40.4%vs 17.1%),ireA(34.0%vs 12.2%)和iucD(12.8%vs2.4%)三种基因检出率显著高于鱼源株(p<0.05)。47株蛙源产ESBLs菌株表现为18种不同的毒力基因谱,最常见的四种毒力谱(菌株数≥5)为fimH-traT-is(10 株)、fimH-traT-iss-bfpA(7 株)、fimH-traT-bfpA(7 株)和fimH-traT-ireA(6 株);相反,41 株鱼源产 ESBLs菌株呈现出8种不同的毒力基因谱,其中有30株毒力基因谱为fimH-traT-iss(25株)或fimH-traT(5株)。5.112株人、鱼、蛙源香港海鸥菌中,检测到IncFrep(83.9%)、IncFIA(69.6%)、IncFIB(33.0%)、IncL/M(25.9%)、IncIl(24.1%)、IncFIC(23.2%)、IncHI2(11.6%)、IncA/C(11.6%)、IncK/B(5.4%)和 IncX(4.5%)共 10个质粒类型,其中以IncF群(IncFrep、IncFIA、IncFIB、IncFIC)质粒最为流行。产ESBLs和非产ESBLs菌株间、多重耐药和非多重耐药菌株间质粒复制子类型分布有所差异。6.香港海鸥菌中1、3类整合酶基因检出率分别为24.1%(27/112)和22.3%(25/112)。产ESBLs香港海鸥菌1类整合子的检出率(28.6%,26/91)显著高于非产ESBLs株(4.8%,1/21)(p<0.05),其中蛙源产ESBLs菌株1类整合子的检出率(42.6%,20/47)显著高于鱼源株(14.6%,6/41)(p<0.05)。27株1类整合子阳性菌株中,22株(81.5%,22/27)共检出五种不同的耐药基因盒,分别为dfrA1和dfrA27(介导磺胺类抗性)、aadA1(介导链霉素抗性)、aacA4(介导庆大霉素抗性)以及arr3(介导利福平抗性)的抗性。蛙源菌株耐药基因盒种类较鱼源株更丰富。7.蛙源产ESBLs菌株中1类整合子与复方新诺明、四环素、链霉素的耐药性存在显着相关性(p<0.05),并且与耐药基因sull,sul2,tetA和tertR的检出也显著相关(p<0.05)。研究结论1.腹泻病人、鱼、蛙源香港海鸥菌产ESBLs检出率高达81.3%,产ESBLs菌株检测到多种β-内酰胺酶基因,以CTX-M-9(90.1%)和TEM(75.8%)为主要流行型别,说明可能多种基因介导产生ESBLs酶。2.产ESBLs菌株还同时携带多种其他常见耐药基因(sull、sul2、tetA、tetR、aac(6’)-Ib-cr)、毒力基因(fimH、bfpA、eaeA、ireA、iucD、hlyA、traT和iss)、整合子和质粒;蛙源产ESBLs菌株较鱼源产ESBLs菌株耐药性更强,多重耐药率更高,耐药模式更复杂,并且携带更多的耐药基因、整合子及耐药基因盒,应值得重点关注。3.IncFrep、IncFIA、IncFIB、IncFIC、IncL/M、IncI1、IncHI2、IncA/C、IncK/B和IncX等10质粒不相容群普遍存在于香港海鸥菌中,其中以IncF群质粒最为流行。产ESBLs和非产ESBLs菌株间、多重耐药和非多重耐药菌株间质粒复制子类型分布有所差异。4.蛙源产ESBLs菌株中1类整合子与复方新诺明、四环素、链霉素的耐药性存在显着相关性,并且与耐药基因sull,sul2,tet 和tetR的检出也显著相关。蛙源产ESBLs菌株磺胺类耐药的原因可能与1类整合子上广泛存在的与磺胺类耐药有关的耐药基因盒(dfrAl、dfrA27)及耐药基因sul有关。