论文部分内容阅读
水稻是中国及亚洲诸国最为重要的粮食作物之一。目前水稻生产中由于磷肥低效,而过度使用磷肥既增加生产成本,也使环境受到污染。因此培育磷高效的作物对于农业生产的可持续发展至关重要。磷肥的利用效率是由植物对磷元素的吸收,转运与生理利用的协同调控所决定的,而在此过程中具有重要功能的因子有磷酸盐转运体(PTs)和其他与磷转运及生理利用相关的调控蛋白。PTs在质膜上执行的功能受到来自转录水平及转录后水平的调控。近年来研究表明,PHF1(磷酸盐转运体转运协助因子1)是调控拟南芥中高亲和转运体PHT1；1的一个关键因子,同时PHT1；1蛋白羧基末端的第514位的丝氨酸受到的磷酸化调控影响该转运体蛋白从内质网到质膜的转运过程。在本研究中,我们通过在30μM的砷酸钠(Na3AsO4·H2O)溶液水培条件下筛选水稻(粳稻日本晴)的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变突变体库,克隆了水稻中PHFl的同源基因OsPHF1(LOC_OsO7g0900),并通过突变体分子鉴定及转基因水稻研究工作定义其功能。在三个图位克隆所确定的phfl等位突变体中,两个突变位置都在跨膜结构域上,而另外一个点突变产生于第五个WD40折叠基序上。这些等位突变体都具有抗砷的表型且磷吸收能力显著降低。突变体研究表明PHF1的氨基末端亲水WD40结构域和跨膜螺旋结构对于其功能都十分重要。研究结果表明,OsPHF1蛋白的突变将导致低亲和转运体OsPT2(LOC_Os03g05640)及高亲和转运体OsPT8(LOC_Os10g30790)在内质网滞留。因为第514位丝氨酸在拟南芥和水稻的PHT1家族中都十分保守,因此OsPHF1对OsPT2/8从ER逃逸的协助作用可能在其他的PT蛋白调控过程中也是保守的。Osphf1突变还能够降低由于OsPHR2超表达而导致的植株地上部有效磷的过度积累。OsPHF1超表达使得正常磷水培条件下植株根,叶中的有效磷超积累。上述结果表明OsPHF1在水稻磷酸盐转运体蛋白家族向质膜运输的过程中的重大作用,从而影响水稻对有效磷的吸收和转运。PHF1蛋白协助PHT1蛋白从内质网到质膜的转运调控在拟南芥和水稻中十分保守,这使得我们可以利用序列比对的生物信息学方法,将拟南芥中的研究成果扩展到作物研究领域中。我们在进一步的研究中通过筛选水稻根部的cDNA文库找到了OsPT8的互作因子-蛋白激酶OsCK2的组成因子OsCK2β3(LOC_Os07g02350). CK2是真核生物中一个非常保守的丝氨酸／苏氨酸磷酸基团转移酶,水稻中组成OsCK2的四个亚基业已报道,它们是：OsCK2a2(LOC_Os07g02350),OsCK2a3(LOC_Os03g10940):OsCK2β1(LOC_Os10g41250), OsCK2β3(LOC_Os07g31280).体外和体内的试验表明OsCK2β3可与OsPT2/8直接互作,并且OsCK2β3对于OsCK2α3和OsPT的磷酸化是必需的。原生质体瞬时转化实验和转基因植株观察发现OsCK2α3/β3的超表达会引起OsPT蛋白在内质网滞留。OsCK2α3/β3超表达和RNA干涉株系都会使转基因植株磷吸收能力发生紊乱,为全酶(由催化亚基α3和调控亚基β3组成)的生物学功能提供了遗传学证明。OsCK2α3/β3的亚细胞定位表明两个亚基都在细胞核中和细胞质中定位,内质网,顺式高尔基体标记荧光蛋白共转化结果表明两个亚基都存在于早期的内膜运输途径中。体外磷酸化试验表明OsCK2β3不具有磷酸化OsPT8亲水羧基末端(OsPT8C-terminal Domain, OsPT8CTD)的能力,而OsCK2α3可作为全酶发挥功能。同时对OsPT8CTD上三个潜在的CK2磷酸化位点进行点突变研究证实了OsPT8CTD上只有第517位的丝氨酸是CK2的磷酸化位点。植物蛋白的体内磷酸化实验进一步为该结论提供了证明。体内实验的数据表明OsPHF1不与磷酸化OsPT8(PTS517D)结合。利用OsCK2α3介导的体外磷酸化修饰的OsPT8CTD与OsPHF1之间的相互作用,我们进一步提供了体外实验证据。与之相对应的,超表达CK2α3/β3无法改变模拟非磷酸化的OsPT蛋白的质膜定位现象,并且OsCK2α3/β3敲除也无法回复phfl突变体的磷吸收能力。因此我们推测植物中的PT蛋白从内质网的逃逸过程同时受到了PHF1和CK2的调控：PHF1与非磷酸化状态的PT蛋白结合并协助其离开内质网,运往质膜；而CK2能够使PT蛋白磷酸化并阻碍其与PHF1的互作。除此以外,对植株的磷酸化分析表明,缺磷显著降低了OsCK2α3/β3介导的OsPT磷酸化。这至少由两个方面决定：(1)OsPHF1在缺磷条件下蛋白积累,从而增强OsPT向质膜转运；(2)OsCK2β3在缺磷条件下降解,OsCK2全酶与OsPT的结合能力降低从而使OsPT的磷酸化程度减弱。上述研究为提高作物磷吸收能力提出了分子改良的一个途径：我们可以将重要的PT蛋白上特定丝氨酸点突变为丙氨酸,从而模拟其非磷酸化状态,阻止CK2的磷酸化修饰作用。不同磷肥条件下的大田试验将用以检测位点突变的水稻品系之间的有效磷吸收利用效率。位点特异突变和筛选策略可作为改善作物磷吸收利用效率分子辅助育种的策略。