论文部分内容阅读
在全球范围内，抗生素的广泛使用，甚至是滥用导致环境中抗生素污染加剧。由于抗生素是一类抑制或杀灭微生物（主要是细菌）的化合物，因此，即便抗生素在环境中浓度很低，但它们对微生物的影响也不容小觑。硝化作用是污水处理厂(sewage treatment plant，STP)生物脱氮的重要过程，其中氨氧化作用是限速步骤;硝化性能主要依赖氨氧化微生物和亚硝酸盐菌的丰度和多样性，所以有必要研究抗生素对硝化微生物的短期冲击影响和长期影响。此外，环境中长期存在抗生素选择压会加剧抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的增殖和传播，因此，有必要研究抗生素的长期选择压对ARGs的出现规律和丰度的影响。本课题研究的抗生素为罗红霉素(roxithromycin，ROX)，ROX是属于大环内脂类的抗生素，其作用机制为抑制微生物蛋白质合成，ROX在环境中不易降解，能够长时间保持活性。然而，目前关于ROX对STP中硝化过程的影响研究还处于空白阶段。因此，本课题主要研究了ROX对SBR系统中硝化过程的短期冲击影响和长期影响，具体研究内容如下: 1、研究ROX短期冲击对活性污泥中氨氧化微生物丰度和多样性的影响。 本试验是基于amoA基因，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)和高通量测序技术研究ROX短期冲击对活性污泥中氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)丰度以及多样性的影响。本试验共设置10种ROX浓度，不同浓度的ROX对氨氧化作用的影响程度不同，环境浓度(0.3～30μg·L-1)与中等浓度(300μg·L-1和3000μg·L-1)的ROX并未对氨氧化作用产生影响;较高浓度(5000～12000μg·L-1)的ROX对氨氧化作用产生明显的抑制作用。环境浓度和中等浓度的ROX均刺激了AOA增长，而较高浓度的ROX导致AOA的丰度下降。此外，除了环境中的痕量浓度(0.3μg·L-1)，其余浓度的ROX均导致AOB丰度下降，且下降趋势比AOA显著，说明AOA对ROX的耐受性高于AOB。高通量测序结果表明，在ROX的选择压下，AOA的OTUs多样性减少，AOB的OTUs多样性增加。对ROX短期冲击耐受性强的AOA为Candidatus Nitrososphaera gargensis和Candidatus Nitrosoarchaeum koreensis.，占总序列的57.70％～97.81％;耐受性强的AOB为Nitrosomonas oligotropha、Nitrosospira multiformis、Nirosococcus watsonii和Nitrosococcus halophilus，占总序列的0.76％～5.10％。RDA结果表明:Ca.Nitrososphaera gargensis、Ca.Nitrosoarchaeum koreensis和N.oligotropha、N.watsonii、N.halophilus均与ROX浓度呈正相关。 2、结合qPCR技术、高通量qPCR技术和高通量测序技术，研究不同浓度ROX对SBR系统中硝化性能以及硝化生物丰度和多样性的长期影响;研究不同浓度的ROX对SBR系统中细菌群落结构和大环内酯类ARGs的长期影响; 本试验选择了3种ROX浓度，分别为0μg·L-1、30μg·L-1和7000μg·L-1。根据不同的抗性机制，选择出10种具有代表性的大环内酯类ARGs进行研究，包括ereA、ereB、ermA、ermB、ermC、mphA、mphB、mphC、mrsA和mefA基因。试验结果发现，30μg·L-1的ROX长期选择压对硝化作用没有影响;7000μg·L-1的ROX长期选择压明显抑制了硝化作用，使氨氧化时间延长，并导致亚硝酸盐积累。7000μg·L-1的ROX长期选择压使AOA和AOB丰度增加，但导致NOB丰度下降。本试验共检测出6种大环内酯类ARGs，分别为ereA、ereB、mphA、mphB、mrsA和mefA基因，在所有样品中ereA基因的相对丰度最高，并且较高浓度的ROX选择压刺激了ereA基因增殖。对ROX长期选择压耐受性较强的AOA为Ca.Nitrososphaera gargensis，敏感的AOA为Candidatus Nitrosopumilus sp.AR2和Nitrosopumilus maritimus;对ROX长期选择压耐受性较强的AOB为Nitrosomonas europaea，敏感的AOB为Nitrosomonas ureae、Nitrosomonas aestuarii、Nitrosomonas eutropha、Nitrosomonas stercoris和N.oligotropha。本试验的结果表明AOA对ROX的耐受性高于AOB。较高浓度的ROX长期选择压显著改变了细菌的多样性。Proteobacteria对7000μg·L-1的ROX选择压敏感;而Actinobacteria对ROX的选择压耐受性强。AOA和AOB amoA基因均和ereB基因呈明显正相关(p＜0.01)，说明AOA和AOB可能携带ereB基因，进而使得AOA和AOB能忍耐ROX的选择压执行氨氧化功能。 3、基于以上试验结果，为了探究ROX后效应对SBR系统中硝化作用以及大环内脂类ARGs的影响，并且为了进一步验证ROX长期选择压的影响，将原本分别投加30μg·L-1和7000μg·L-1ROX的R2和R3改为不投加ROX的R2和R3;而将R1的对照系统改为投加7000μg·L-1ROX的系统; 试验结果表明30μg·L-1的ROX长期选择压对硝化作用完全没有影响;7000μg·L-1的ROX长期选择压明显抑制了硝化作用，并且当SBR系统中不存在ROX选择压时，系统能够恢复硝化功能。在本阶段AOA丰度无明显变化，而AOB的丰度变化较明显;7000μg·L-1的ROX长期选择压仍然导致NOB丰度下降。10种大环内酯类ARGs在本阶段全部被检测出，相对丰度最高的4种大环内酯类ARGs依次为:ereA基因、ermB基因、mphA基因和mefA基因。耐受性强的Ca.Nitrososphaera gargensis逐渐取代其它的AOA，在3个SBR中占绝对优势;而在较高浓度的SBR(R1)中耐受性强的AOB N.europaea同样几乎取代了其它的AOB。Proteobacteria在该阶段逐渐适应了ROX的长期选择压，相对丰度呈增加的趋势。 4、基于DNA-SIP技术和高通量测序技术相结合的分子生物学手段，研究ROX的长期选择压对活性氨氧化微生物群落结构的影响。 将SD和反应器第一阶段运行结束后3个SBR种的活性污泥进行DNA-SIP培养，试验结果表明，每个样品中AOA和AOB的amoA基因均被标记上13C，证明在不同浓度的ROX长期选择压下，SBR系统中的AOA和AOB均参与了氨氧化过程。每个样品的重层DNA的高通量测序结果表明，在13C标记处理的重层DNA中活性AOA的丰度高于活性AOB;Nitrososphaera sp.JG1、Candidatus Nitrososphaera evergladensis和Ca.Nitrososphaera gargensis为活性AOA，而活性AOB主要有Nitrosomonas marina、N.oligotropha、Nitrosomonas sp.HP8和Nitrosomonas mobilis组成。此外，研究发现，在丰度上占绝对优势的AOA或AOB未必会主导氨氧化作用。