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本研究在自行成功研制的鼠抗人CD80阻断型单克隆抗体(4E5)的基础上,采用嵌合抗体构建方法,在真核细胞CHO中实现稳定表达,并对嵌合抗体生物学功能进行初步研究。第一部分:CD80鼠-人嵌合抗体的构建及表达从4E5杂交瘤细胞中抽取总RNA,常规逆转录,应用简并引物进行PCR扩增。根据重、轻链基因序列设计引物,应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的V_H和V_L基因。同时用特异性引物从pIRES/hu5C11质粒中扩增人IgG1γ链的Fc、CH1及κ链的Cκ基因。再利用TP-PCR方法分别将Fc、CH1和含信号肽序列的V_H序列进行拼接得到嵌合重链,Cκ与含信号肽序列的V_L序列进行拼接获得嵌合轻链。构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒pIRES/ch4E5。pIRES/ch4E5重组质粒用脂质体法转染293T细胞,经FCM检测培养上清中嵌合抗体的瞬时表达后,再转染CHO细胞,经G418加压筛选,获取持续稳定分泌嵌合抗体的CHO-ch4E5细胞。研究结果表明:成功构建了含嵌合重、轻链基因的真核表达载体pIRES/ch4E5,并分别在293T及CHO细胞中得到瞬时表达及稳定表达。第二部分:CD80鼠-人嵌合抗体生物学功能的初步研究大量收集CHO-ch4E5细胞无血清培养上清,经protein G亲和层析法纯化及Lowry法定量,SDS-PAGE鉴定嵌合抗体的纯度及分子量,FCM分析嵌合抗体对多种肿瘤细胞Daudi、SH2-1及U937等细胞膜型CD80分子的识别。选择天然高表达CD80分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi(阳性表达率＞90%)与ch4E5(终浓度为10μg/ml)共培养,MTT和FCM分析ch4E5对Daudi细胞的生长与存活的影响。采用竞争抑制法分析ch4E5与母本抗体的竞争抑制作用及MTT对MLR的影响作用。ELISA检测ch4E5与PBLs共培养后IL-2、INF-γ及IL-10的水平。结果表明:CHO-ch4E5细胞培养上清中嵌合抗体的得率为4～5.8 mg/L。ch4E5能够与4E5相互竞争抑制抗原抗体结合,并有效识别Daudi细胞膜型CD80分子(结合率为95.5%)。ch4E5能有效抑制Daudi细胞体外增殖(P=0.000067＜0.05),并诱导其凋亡。ch4E5抑制PBLs体外增殖(P=0.000012＜0.05),下调分泌IL-2(P=0.000156＜0.05)及INF-γ(P=0.000001＜0.05),上调分泌IL-10(P=0.000035＜0.05)。提示CD80嵌合抗体具有良好的生物学活性。本研究获得的成果:1、成功构建了抗人CD80鼠-人嵌合抗体(ch4E5)真核表达质粒。2、获得了稳定分泌嵌合抗体的细胞株CHO-ch4E5及相应的纯品抗体。3、CD80嵌合抗体可有效抑制天然高表达CD80分子的人B淋巴瘤细胞株Daudi的体外增殖;抑制混合淋巴细胞反应。该抗体在某些肿瘤的免疫治疗及移植抗排异中具有潜在的应用价值。