目的：　　 肝炎可由多种因素引起,比如自身免疫反应、病毒感染、酗酒、药物和化学毒物等,然而促使各种肝炎肝细胞损伤的免疫作用机制基本相同。刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)诱导的急性肝损伤是近年来新发展起来的的自身免疫性肝损伤模型,已被国内外学者广泛应用于免疫性肝损伤机制的研究。　　 大量研究成果表明,ConA诱导的肝损伤主要为效应细胞(如T细胞、NKT细胞、NK细胞等)向肝内募集并活化:活化的效应细胞分泌大量细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5等),进而引发肝细胞损伤,但何种效应细胞及细胞因子在其中起主导作用并通过何种途径诱导肝细胞损伤,尚未完全明确。近年来,研究发现库普弗细胞(Kupffer,cell,KC)消耗小鼠可以明显抑制ConA所致的肝损伤,证明活化的KC在ConA诱导性肝损伤的发生发展中起着至关重要的作用,但其促进ConA诱导性肝损伤的免疫作用机制是尚不明确,研究KC在ConA诱导性肝损伤中的作用,可深入了解ConA诱导的自身免疫性肝损伤的作用机制,为临床免疫性肝病的治疗提供更加广阔的前景。　　 本研究通过体内外实验探讨KC与ConA诱导的肝损伤相关细胞因子IFN-γ、IP-10、TNF-α及其他效应细胞之间的相互作用关系,进一步分析KC在ConA诱导性肝损伤中的重要作用。　　 方法：　　 1、实验动物的处理　　 (1)ConA诱导小鼠肝损伤模型:　　 C57BL/6J雌性小鼠(6-8周)尾部静脉注射ConA(15mg/kg,体重)。　　 (2)消耗小鼠KC后ConA诱导肝损伤模型的建立及取材:　　 C57BL/6J雌性小鼠(6-8周)静脉注射100μl脂质体(liposome)或脂质体包裹的Clodronate(5mg/ml),48小时后再次注射相同剂量,24小时后尾部静脉注射ConA(15mg/kg,体重)。　　 2、肝组织总mRNA的提取及肝组织中IFN-γ、IP-10、TNF-αmRNA的表达水平测定　　 将肝组织在TRIsure试剂中均质化,使用标准的方法从肝组织中提取总RNA,将总RNA反转录为cDNA,实时定量PCR仪测定Ct值,采用AACt法分析各实验组小鼠肝组织中IFN-γ、IP-10、TNF-α的表达水平。　　 3、肝组织白细胞提取及肝组织白细胞中效应细胞百分率的测定　　 使用标准的的方法从肝组织中提取白细胞,用FACS缓冲液配置107/ml细胞悬液,加入PE/FITC标记的荧光抗体组:FITC标记的抗CD8抗体,PE标记的抗CD4抗体;FITC标记的抗CD69抗体,PE标记的抗CD4抗体;FITC标记的抗CD3抗体,PE标记的抗NK1.1抗体;FITC标记的抗F4.80抗体,PE标记的抗CD11b抗体,使用流式细胞仪分析各组标记的细胞在肝组织白细胞中的百分率。　　 4、受IFN-γ体外诱导后,KC中IFN-γ、IP-10、TNF-αmRNA的表达水平测定　　 从未经处理的小鼠肝组织中提取肝组织白细胞,使用CD11b免疫微磁珠及MASC免疫磁珠分选仪分选出CD11b+细胞,在含10%FCS的RPMI培养液中37℃孵育六小时,弃上清,KC仍粘附于培养皿底部,加入含IFN-γ(10ng/ml)的含有10%FCS的RPMI培养液37℃孵育六小时后弃上清,使用Rneasy试剂盒,提取KC总RNA,将总RNA反转录为cDNA,,实时定量PCR测定其IFN-γ、IP-10、TNF-αmRNA的表达水平。　　 结果：　　 1、ConA诱导小鼠肝损伤　　 小鼠尾部静脉注射ConA(15mg/kg体重)后3小时、6小时、12d及24小时肝组织病理切片显示小鼠3小时开始出现渐进性的肝细胞损伤,血清ALT水平逐渐升高,12d小时左右后达到最高峰后逐渐下降。　　 2、ConA注射后肝组织中IFN-γ、IP-10、TNF-α的表达水平　　 ConA注射后3d,时、6d,时及12小时,肝组织中IFN-γ、IP-10、TNF-αmRNA的表达水增高且均在ConA注射后3d,时左右达到最高峰。　　 3、KC消耗后,ConA诱导的小鼠肝损伤　　 ConA注射后12小时,肝组织切片HE染色结果显示KC消耗组小鼠对比对照组小鼠肝组织坏死及凋亡的区域明显减小,损伤明显减轻;KC消耗小鼠血清ALT水平对比对照组明显减低(p＜0.01)。　　 4、KC消耗小鼠肝脏中IFN-γ、IP-10、TNF-α仅的表达水平　　 ConA注射3小时及12小时后,除了12小时KC消耗小鼠肝脏IFN-γ表达水平与对照组相比无明显变化外,IFN-γ、IP-10、TNF-α的表达水平比对照组均明显减小(ConA注射后3小时及12小时P值分别为p＜0.05及p＜0.001)。　　 5、IFN-γ体外诱导KC表达IFN-γ、IP-10、TNF-α水平　　 结果分析显示IFN-γ可以体外诱导KC表达IP-10、TNF-α(p＜0.01)。结合结果四提示ConA诱导的肝损伤中IP-10和TNF-α主要来源于KC。　　 6、KC消耗小鼠肝组织白细胞中活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞百分比　　 ConA注射后12小时,KC消耗小鼠肝脏中活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞百分比相对于对照组明显减低(p＜0.01)。　　 结论：　　 1、IFN-γ、IP-10、TNF-α是参与ConA所致肝损伤的重要细胞因子。　　 2、KC在ConA诱导的肝损伤中参与IFN-γ、IP-10、TNF-α的产生。　　 3、IP-10和TNF-α主要来源于KC。　　 4、T细胞等效应细胞可能通过分泌IFN-γ诱导KC分泌IP-10、TNF-α。　　 5、KC可能通过分泌IP-10趋化T细胞、NK细胞、NKT细胞等效应细胞向肝脏的募集,促进肝细胞损伤。