禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类呼吸道疾病综合征，自从1878年首次报道以来，在世界范围内广泛存在，无论是高致病性禽流感病毒还是低致病性禽流感病毒都给我国养殖业和公共卫生事业带来了重大的威胁。2011年从我国吉林、山东和福建三个省的98份野鸭粪便中分离鉴定出7株H5N1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV），HA基因的进化分析表明分布于以上三个省份的5株病毒属于2.3.2.1分支，来自山东省的2株病毒分别属于2.3.4和7.2分支，表明不同分支的AIV在我国局部地区呈现共同流行的趋势。7株病毒的HA基因核苷酸同源率在88.2%~99.6%之间，与各自分支代表株的核苷酸同源率在95%以上，与国内目前流行毒株也具有较高的同源性，其中，分离毒株A/wild duck/Shandong/1/2011, A/wild duck/Shandong/628/2011和A/wild duck/Jilin/ZF/2011的内部基因来自不同的分支，属于重组病毒。SPF鸡和鸭的人工感染实验结果表明3个分离毒株对SPF鸡和鸭均具有致病性，2.3.2.1分支的病毒比2.3.4和7.2分支的病毒的致死率高。为了解我国目前H9N2亚型AIV HA基因的遗传变异情况，对我国不同地区分离的10株H9N2亚型AIV的HA基因进行同源性和遗传进化分析。结果表明，分离毒株的裂解位点均为PS/ARSSR↓GLF，符合低致病性AIV的分子特征；具有7~9个潜在糖基化位点，在127、148和295位增加了新的糖基化位点；与参考株相比，受体结合位点除190位有变异外，其它位点均较保守；6株病毒的226位氨基酸均为L，具有与哺乳动物唾液酸α-2,6受体结合的特征；分离毒株HA基因的核苷酸序列同源率在88.7%~99.8%之间；分离毒株同属于欧亚谱系中的A/Duck/HongKong/Y280/97群，根据核苷酸同源性差异大于5%为基准，分为4个不同的亚群：Y280-like-1,Y280-like-2, Y280-like-3和Y280-like-4，其中Y280-like-1亚群的病毒为优势毒株，在我国不同的地区广泛流行。动物感染实验表明，Y280-like-1亚群的A/chicken/Beijing/15/2011和Y280-like-4亚群的A/chicken/Nanjing/17/2011比其它两个亚群的分离毒株在SPF鸡体内的复制能力较强。为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感疫苗株，筛选出一株细胞高度适应的流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2)(SH11)，成功构建了反向遗传操作系统，拯救出亲本毒株rSH11。生物学实验结果表明rSH11经MDCK细胞连续5次传代后血凝效价可稳定在1:1024，rSH11的鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、遗传稳定性等方面都与亲本毒株保持一致，表明rSH11具有细胞高度增殖的特性。以rSH11为抗原制备油乳剂灭活苗，免疫4周龄SPF鸡，一免1周后即可检测出HI抗体，免疫后3周HI抗体平均效价高于1﹕700，表明其有良好的免疫原性。攻毒保护实验表明rSH11疫苗对不同分支的H9N2亚型毒株的攻毒能够产生良好的免疫保护，显著抑制免疫鸡排毒。为了利用rSH11反向遗传操作平台构建能在动物细胞中高度增殖的病毒，本研究进行了HA和NA基因替换实验，成功拯救出3株不同分支的H9N2亚型重组病毒。综上所述，本研究通过对H5N1和H9N2亚型AIV遗传特性及致病性的分析为禽流感疫情的防控及疫苗的研制提供了重要的理论依据。同时，通过rSH11反向遗传操作平台的建立为AIV相关细胞苗的研制奠定了基础。