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目的:本实验研究PM2.5暴露下诱导肺部产生EndMT的分子机制以及复方精油的保护作用。探讨lncRNA Gm16410在PM2.5暴露下调控TGF-β1/Smad2/3通路致肺部发生EndMT的作用。这些发现为PM2.5暴露后肺部EndMT的损伤修复和干预方案提供新的思路。方法:本研究以Balb/c小鼠为体内实验模型,MHC(原代小鼠肺微血管内皮细胞)和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)为体外实验模型。(1)PM2.5样品采集、处理:采集2015年10月至2016年3月在河北省廊坊市的PM2.5。将PM2.5石英滤膜浸泡在70%乙醇溶液中,超声处理后将PM2.5颗粒和滤膜分离,滤液经旋转蒸发和冷冻干燥后得到PM2.5颗粒,并放入-20℃冰箱中备用。称取一定量PM2.5颗粒,用无菌生理盐水配制10 mg/m L悬液,超声震荡后使用。(2)体内实验:Balb/c小鼠经PM2.5(300μg/m3)动态染毒及1%复方精油静态吸入干预。利用HE染色、Masson染色和免疫组化法,观察小鼠肺部病理变化、胶原蛋白沉积程度以及EndMT的发生情况;利用q PCR检测小鼠肺部EndMT相关基因CD31、CDH5、Acta2和COL1α1的表达;通过Western blot检测小鼠肺部EndMT相关蛋白CD31、CD34、CDH5、Vimentin、Col1、Acta2和S100A4的表达;利用基因芯片、q PCR筛选出PM2.5暴露下小鼠肺组织中具有统计学意义的差异性表达的lncRNA。(3)体外实验:PM2.5组分别作用两种细胞0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48h,复方精油组分别作用两种细胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h。通过MTT和细胞划痕实验分析细胞活力和细胞迁移能力的变化,从而评估细胞功能的改变;利用q PCR检测不同作用时间下两种细胞EndMT相关因子CD31、CDH5、Acta2和COL1α1的表达;利用Western blot检测两种细胞EndMT相关因子CD31、CDH5、Col1、Acta2和S100A4的表达;利用免疫荧光法检测两种细胞内CD31、Acta2和S100A4的荧光强度变化,结合体内实验探究复方精油对于PM2.5暴露下诱导肺部EndMT的保护作用。在PM2.5作用下加入TGF-β通路抑制剂SB431542,通过Western blot检测TGF-β1、TGF-βR1、Smad2/3、p-Smad2/3和EndMT相关因子的变化情况,判断TGF-β1/Smad2/3通路在PM2.5诱导肺部发生EndMT中的作用。筛选出表达稳定且具有统计学意义的lncRNA Gm16410,利用细胞划痕实验分析lncRNA Gm16410过表达后MHC细胞迁移能力的改变;利用Western blot检测lncRNA Gm16410过表达后TGF-β1、TGF-βR1、Smad2/3、p-Smad2/3和EndMT相关因子CD31、CDH5、Col1、Acta2和S100A4的变化情况,探究lncRNA Gm16410在PM2.5调控TGF-β1/Smad2/3通路诱导肺部发生EndMT中的作用。结果:(1)体内实验:HE染色结果显示对照组肺部未见异常,PM2.5组肺部有局灶性充血、出血和炎性细胞浸润;复方精油干预后,小鼠肺部出血和炎症细胞数量都有所减少。Masson染色结果表明,PM2.5组中肺部血管周围胶原染色面积略有增加;与PM2.5组比较,复方精油组胶原染色面积变化不大。免疫组化实验结果显示,PM2.5组中Acta2的表达明显增多;与PM2.5组相比,复方精油组中Acta2的表达明显减少。q PCR检测PM2.5组中CDH5和CD31的表达水平明显下降,Acta2和COL1α1的表达水平显著升高;与PM2.5组相比,复方精油组CDH5和CD31的表达水平显著增高,Acta2和COL1α1的表达水平显著下降。Western blot检测PM2.5组中CD31、CD34表达水平略有下降,CDH5表达水平明显下降,Col1和Acta2的表达水平增加,但Vimentin没有显著改变;复方精油组中CD31和CD34的表达水平上调,CDH5表达水平明显上调,Col1、Acta2和Vimentin的表达水平下降。(2)体外实验:MTT实验结果表明,PM2.5作用24 h后明显提高了MHC细胞的活性,在36 h和48 h时MHC细胞的活性最高;复方精油组的细胞活性并没有显著改变。细胞迁移实验中,PM2.5作用细胞36 h后,细胞迁移能力开始增强,PM2.5作用细胞48 h后,细胞迁移能力显著增强;复方精油可减弱PM2.5对细胞迁移能力的影响。q PCR结果表明,Acta2和COL1α1在基因水平上的表达随PM2.5作用时间的延长而显著升高,而CDH5和CD31的表达水平显著降低。在蛋白水平上,CDH5和CD31的表达水平逐渐减少,Col1、Vimentin、Acta2和S100A4的表达水平逐渐增加;复方精油在体外对PM2.5诱导产生的EndMT有良好的干预作用,尤其是在蛋白水平上。免疫荧光法结果显示,各指标的荧光强度变化趋势与上述实验相一致。综合体内外实验结果表明,复方精油可缓解PM2.5暴露下诱导产生的肺部EndMT。Western blot结果显示,在PM2.5作用MHC细胞48 h后,TGF-β1、TGF-βR1和p-Smad2/3的表达水平上升,但加入TGF-β通路抑制剂SB431542后,TGF-β1、TGF-βR1和p-Smad2/3的表达水平下降显著,EndMT相关因子的表达水平也有所逆转。免疫荧光法结果显示,各指标的荧光强度变化趋势与上述实验相一致。结果表明,PM2.5可通过激活TGF-β1/Smad2/3通路诱导肺部发生EndMT。q PCR结果显示,在MHC细胞中,随着PM2.5作用时间的延长,lncRNA Gm16410的表达水平逐渐下降。细胞迁移实验结果表明,相较PM2.5组而言,在PM2.5+lncRNA Gm16410过表达组中MHC细胞的迁移能力在48 h有所下降。Western blot结果表明,在PM2.5+lncRNA Gm16410过表达组中,TGF-β1/Smad2/3通路中相关因子TGF-β1、TGF-βR1和p-Smad2/3的表达下降,EndMT相关因子Col1、Acta2和S100A4的表达下降,CD31和CDH5的表达上升。结果表明,通过质粒过表达lncRNA Gm16410可以逆转PM2.5诱导的细胞迁移、EndMT的标志物水平以及TGF-β1/Smad2/3通路的改变,提示lncRNA Gm16410通过调控TGF-β1/Smad2/3通路参与PM2.5暴露下诱导产生的EndMT。结论:(1)复方精油可缓解PM2.5暴露下诱导发生的肺部EndMT。(2)PM2.5暴露下通过下调lncRNA Gm16410的表达激活TGF-β1/Smad2/3通路从而诱导肺部发生EndMT。