【摘 要】
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木聚糖酶被广泛应用于造纸、饲料加工、食品以及能源等方面。本实验室从黑曲霉A-09中筛选出一株GH10木聚糖酶,但是由于其温度适应性及热稳定性太低,无法满足工业生产需求。课题组前期的工作中均显示C2能显著提高木聚糖酶XynⅢ（X）的催化能力和稳定性。基于此,本研究将C2融合到GH10家族木聚糖酶基因的端部,以期待的到改良后酶学性质更优良的GH10家族木聚糖酶,同时为C2融合木聚糖酶提高稳定性的普适性
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木聚糖酶被广泛应用于造纸、饲料加工、食品以及能源等方面。本实验室从黑曲霉A-09中筛选出一株GH10木聚糖酶,但是由于其温度适应性及热稳定性太低,无法满足工业生产需求。课题组前期的工作中均显示C2能显著提高木聚糖酶XynⅢ（X）的催化能力和稳定性。基于此,本研究将C2融合到GH10家族木聚糖酶基因的端部,以期待的到改良后酶学性质更优良的GH10家族木聚糖酶,同时为C2融合木聚糖酶提高稳定性的普适性意义提供理论依据,论文结果如下:1)重组质粒的构建:利用二步反向PCR和同源重组技术,成功构建了长度不同、位置不一的Linker连接的重组质粒 pET20b-C2G、pET20b-GC2、pET20b-GmC2、pET20b-GlmC2、pET20b-C2GC2、pET20b-C2GmC2、pET20b-C2GlmC2。转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞后,筛选转化子。经DNA测序完全正确后,用IPTG诱导蛋白表达,测定酶学性质。2)酶学性质:GH10、C2G、GlmC2和C2GlmC2纯酶的最适pH均为5.6,与野生型保持一致;最适温度分别为40℃、45℃、45℃和50℃,与野生型GH10相比单端融合酶最适反应温度提高了 5℃。更值得注意的是,双端融合酶比野生型提高了10℃。结构域融合的融合酶都具有更宽泛的温度适用性。3)热稳定性:GH10、C2G、GlmC2 和 C2GlmC2 纯酶在 50℃下的 t1/2 分别为 13min、91 min、57 min 和 463 min。C2G、GlmC2 和 C2GlmC2 在 50℃下的 t1/2 比野生型分别提高了 6.06 倍、3.80 倍、30.80倍;同时双端融合的C2GlmC2比单端融合的C2G、GlmC2分别提高了 5.08倍和8.12倍,C2GlmC2在80℃下仍然有73min的半失活时间。4)动力学分析:以山毛榉木聚糖为底物,C2GlmC2的Km值为2.19mg·mL-1,比GH10（Km为2.43 mg·mL-1）减小了 0.24个单位,说明C2GlmC2对底物的亲和能力有所提升;C2G和GlmC2的Km值分别为7.31 mg·mL-1和6.24 mg·mL-1,较GH10分别增大了 4.88和3.81个单位,C2G和GlmC2对底物的亲和能力较GH10有所降低。融合酶C2GlmC2、C2G、GlmC2的催化能力均有不同程度的提高,Kcat值分别为:2070.79 s-1、2832.993s-1、2364.82s-1 比野生型（Kcat值为 1638.78s-1）提高了 1.26 倍、1.72倍、1.44倍。N端和C端融合C2结构域后,有效的提升了 GH10木聚糖酶的稳定性以及对底物的催化能力。而双端融合C2结构域后GH10木聚糖酶的热稳定性有了更为显著的提高,进一步证明了双端融合C2能够实现功能的叠加,同时也证实了 C2在提升木聚糖酶热稳定性方面具有一定的普适性意义。
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