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目的:三邻甲苯磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)属于三甲苯磷酸酯(tricresyl phosphate,TCP)的三种同分异构体之一,是一种有机磷酯(organophosphate,OP),由于其具有良好的相容性、阻燃性、防霉性及耐磨性等特点,作为一种增塑剂被广泛应用于现代工业。TOCP可经呼吸道、消化道、皮肤吸收进入机体内,对机体多个系统造成损伤,并产生急性和迟发性的神经毒性。近年来,研究显示TOCP暴露也可产生生殖毒性,如导致雄性精子数量的下降和活力的降低。对雌性可减少原始卵泡、窦前卵泡及成熟卵泡的数量。妊娠期间,TOCP暴露将导致孕鼠产仔数的下降、胎儿体重降低以及胎儿流产率的升高。TOCP进入体内后,除了可富集于肺、胆囊和肝脏等脏器外,还可通过胎盘进入胎儿体内。在机体妊娠过程中,胎盘和卵巢黄体对妊娠建立和维持具有十分重要的作用。然而,有关妊娠期间TOCP暴露对胎盘生长发育、妊娠黄体功能以及其对跨代遗传效应的影响和作用机制,均未见相关的研究报道,故本研究拟观察妊娠期间TOCP暴露对小鼠胎盘生长发育、卵巢黄体功能和跨代遗传效应的影响及其作用机制。方法:选择体重约28-30克、6-8周龄成年SPF级未交配过的雌性昆明小鼠,从妊娠第1天(gestational day 1,GD1),采取不同剂量TOCP(100、200、400mg/kg/day)灌胃处理,对照组则以植物油代替,分别于妊娠第8天(GD 8)及第13天(GD 13)采集标本,将提取的肝脏、肾脏、胎盘、卵巢及子宫等组织进行拍照、称重、统计胚胎着床数,并提取血清低温保存。通过HE染色观察胎盘微细结构;通过荧光定量PCR法检测胎盘生长与发育基因Ascl-2、Esx1、Hand1和Hand2m RNA的表达情况;通过免疫组织化学法检测胎盘细胞增殖相关抗原PCNA的表达情况;通过免疫印迹法检测胎盘细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、P53及自噬相关蛋白Becline-1、Atg5、LC3的表达;通过生化试剂盒检测胎盘氧化应激指标过氧化氢(hydrogen peroxide H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和抗氧化应激指标超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)含量的变化;采用放射免疫法测定其血清中的雌、孕激素;并观察对比卵巢妊娠黄体数目和面积;通过real-time PCR法检测卵巢甾体类固醇激素合成相关酶基因Cyp11a1、Hsd3b1和St AR的m RNA的表达变化;通过生化试剂盒检测卵巢组织中氧化应激反应相关指标的变化情况;通过蛋白免疫印迹法观察凋亡和自噬相关蛋白表达水平的变化。为观察TOCP对胎鼠产生影响,我们通过对妊娠小鼠从GD 1开始每天按照各实验组剂量(1,10,100 mg/kg/day)对妊娠小鼠进行灌胃直至分娩,Control组以植物油代替,分别在F1、F2和F3代出生后(postnatalday,PND)49天对所需要的标本进行收集,观察其新生仔鼠体重、肛殖距、每胎产仔数、各脏器重量和脏器系数、生殖器官重量的改变以及通过q PCR观察F3代雌鼠卵巢DNA甲基化转移酶m RNA表达水平的变化。结果:第一部分妊娠期TOCP暴露对小鼠胎盘生长发育的影响及其作用机制(1)不论是GD 8还是GD 13,各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露对小鼠子宫、肝脏和肾脏的重量及各脏器系数,与Control组相比较,均无明显差异(P>0.05)。(2)GD 8,胚胎植入数量上,与Control组相比,100mg/kg/day TOCP组无明显影响(P>0.05),而200mg/kg/day组及400mg/kg/day组则明显下降(P<0.05),并可见胚胎吸收现象。在GD 13,其胚胎数量与Control组相比,100mg/kg/day组无明显差异(P>0.05),而在200mg/kg/day组及400mg/kg/day组其植入胚胎数则明显下降(P<0.05),同时可见胚胎吸收现象。另外,各TOCP暴露组(100,200,400 mg/kg/day)胚胎重量均显著高于Control组(P<0.001),100mg/kg/day组胎盘重量显著高于Control组(P<0.05),其它TOCP暴露组与Control组相比无明显差异(P>0.05),各实验组还可见胚胎吸收后的残留胎盘组织。(3)在GD 8,各TOCP暴露组与Control组相比,外胎盘锥(EPC)发育明显较差,尤其是在200mg/kg/day组及400mg/kg/day组,EPC结构破坏较明显。在GD 13,不同浓度的TOCP暴露组(100,200,400 mg/kg/day)的胎盘总面积显著下降了(P<0.001)。此外,TOCP暴露还显著减少了胎盘海绵滋养层(P<0.001)和迷路层(P<0.001)的面积。(4)在GD 8,与Control组相比,暴露在不同剂量的TOCP(100,200,400mg/kg/day)均显著抑制胎盘中Ascl2、Esx1 m RNA的表达(P<0.01);而Hand1m RNA的表达在400 mg/kg/day组受到抑制(P<0.05);Hand2 m RNA的表达在100 mg/kg/day组受到抑制(P<0.001),在400 mg/kg/day组反而升高(P<0.01)。而在GD 13,与Control组相比,各剂量的TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组Ascl2、Esx1、Hand1、Hand2 m RNA表达均明显下调(P<0.001)。(5)与对照组相比,TOCP暴露后不论在GD 8还是GD 13小鼠胎盘PCNA阳性细胞数呈剂量依赖性显著降低(P<0.05或P<0.001)。(6)在GD 8,与Control组相比,P53表达无明显改变(P>0.05),Bcl-2则在100mg/kg/day及400 mg/kg/day组表达明显降低(P<0.05或P<0.01),Bax则在400 mg/kg/day组表达明显升高(P<0.001)。而在GD 13,与Control组相比,P53在400 mg/kg/day组表达明显升高(P<0.05),Bcl-2则在100mg/kg/day、200mg/kg/day及400 mg/kg/day组表达均极明显降低(P<0.001),Bax则在200mg/kg/day及400 mg/kg/day组表达明显升高(P<0.001)。(7)在GD 8,与Control组相比,Beclin-1在400 mg/kg/day组表达明显升高(P<0.05),Atg5则在100mg/kg/day、200mg/kg/day及400 mg/kg/day组表达均明显升高(P<0.05或P<0.01),LC3-II/LC3-I则在400 mg/kg/day组明显升高(P<0.01)。而在GD 13,与Control组相比,Beclin-1在200mg/kg/day及400mg/kg/day组表达明显升高(P<0.05或P<0.01),Atg5则在各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组表达均明显升高(P<0.05),LC3-II/LC3-I也在各TOCP暴露组表达明显升高(P<0.05或P<0.001)。(8)在GD 8中,与Control组相比,氧化应激指标MDA在100mg/kg/day及400mg/kg/day组明显升高(P<0.05);H2O2在100mg/kg/day、200mg/kg/day及400mg/kg/day组均明显升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001);抗氧化应激指标CAT在100mg/kg/day组明显下降(P<0.01),但在400 mg/kg/day组却明显升高(P<0.01);SOD在100mg/kg/day及200mg/kg/day明显下降(P<0.001或P<0.05),但在400 mg/kg/day组却明显升高(P<0.001)。在GD 13中,与Control组相比,氧化应激指标MDA在200mg/kg/day及400 mg/kg/day组明显升高(P<0.05);H2O2在200mg/kg/day及400 mg/kg/day组均明显升高(P<0.05或P<0.001);抗氧化应激指标CAT在各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组均明显下降(P<0.05或P<0.01);SOD也在各TOCP暴露组均明显下降(P<0.001)。第二部分妊娠期TOCP暴露对小鼠卵巢黄体功能的影响及其作用机制(9)结果表明,在GD 8血清中雌二醇含量,与Control组相比,100mg/kg/day组无明显差异(P>0.05),200mg/kg/day组及400mg/kg/day组则明显升高(P<0.05),而在GD 8孕酮含量,Control组与其它各TOCP暴露组之间无明显差异(P>0.05)。在GD13血清中雌二醇含量,Control组与TOCP暴露组之间无明显差异(P>0.05),而孕酮含量,与Control组相比,100mg/kg/day组及400mg/kg/day组下降极明显(P<0.001),且200mg/kg/day组与Control组相比,也明显下降(P<0.05)不论是在GD 8还是在GD 13,Control组与各TOCP暴露组之间卵巢重量无明显差异(P>0.05)(10)不论在GD 8还是GD 13,卵巢黄体数量上各剂量TOCP(100,200,400mg/kg/day)暴露组与Control组相比,无统计学差异(P>0.05)。而在GD 8,在400 mg/kg/day组卵巢黄体的相对面积明显下降(P<0.05),在GD 13,在100mg/kg/day和400 mg/kg/day组卵巢黄体的相对面积明显下降(P<0.01或P<0.05)。各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组与Control组相比,其卵巢分泌相关基因的表达均明显下调(P<0.001)。(11)在GD 8,与Control组相比,P53和Bcl-2表达无明显改变(P>0.05),Bax则在200mg/kg/day和400 mg/kg/day组表达明显升高(P<0.05)。而在GD 13,与Control组相比,P53在各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组表达均明显升高(P<0.01),Bcl-2则在200mg/kg/day及400 mg/kg/day组表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),Bax则各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组表达均明显升高(P<0.05或P<0.001)。(12)为在GD 8,与Control组相比,Beclin-1在各剂量TOCP(100,200,400mg/kg/day)暴露组表达均明显升高(P<0.01或P<0.001),Atg5及LC3-II/LC3-I各TOCP暴露组与Control组相比无明显差异(P>0.05)。而在GD 13,与Control组相比,Beclin-1在各剂量TOCP暴露组表达均明显升高(P<0.001,P<0.05或P<0.01),Atg5则在100mg/kg/day、400mg/kg/day组表达明显升高(P<0.01或P<0.05),LC3-II/LC3-I各TOCP暴露组与Control组相比无明显差异(P>0.05)。(13)在GD 8中,与Control组相比,氧化应激指标MDA在各剂量TOCP(100,200,400 mg/kg/day)暴露组明显升高(P<0.01,或P<0.001);H2O2在100mg/kg/day、200mg/kg/day及400mg/kg/day组呈现剂量依赖性明显升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001);抗氧化应激指标CAT和SOD都在100mg/kg/day、200mg/kg/day及400mg/kg/day组明显下降(P<0.001)。在GD 13中,与Control组相比,氧化应激指标MDA在各剂量TOCP(100,200,400mg/kg/day)暴露组均明显升高(P<0.01或P<0.001);H2O2在各剂量TOCP暴露组均明显升高(P<0.05或P<0.01);抗氧化应激指标CAT在400 mg/kg/day组均明显下降(P<0.01);SOD在各剂量TOCP暴露组均明显下降(P<0.05或P<0.001)。第三部分妊娠期TOCP暴露对小鼠跨代遗传的影响及其作用机制(14)在F1代,新生仔鼠体重与Control组相比,1mg/kg/day组明显增加(P<0.01);而肛殖距在100mg/kg/day组明显下降(P<0.05);每胎产仔数量在100mg/kg/day组明显下降(P<0.01);而在F2代,每胎产仔数量在与Control组相比,各TOCP暴露组(1、10、100mg/kg/day)均明显下降(P<0.05或P<0.01);在F3代,新生仔鼠肛殖距,与Control组相比在1 mg/kg/day组及100mg/kg/day组则显著下降(P<0.01或P<0.001);每胎产仔数量在100 mg/kg/day组明显下降(P<0.05),其余则无统计学差异(P>0.05)。(15)在雌鼠,与Control组相比,F1代体重中,100mg/kg/day组明显下降(P<0.05);在雄鼠,与Control组相比,F1代体重中,10mg/kg/day组明显上升(P<0.01);其余各TOCP暴露组则无统计学差异(P>0.05)。(16)在雌鼠F1代,卵巢重量在10mg/kg/day及100mg/kg/day组明显降低(P<0.01或P<0.05),1mg/kg/day组则无统计学差异(P>0.05);在F3代中,子宫重量和子宫系数,与Control组相比,在10mg/kg/day及100mg/kg/day组均明显降低(P<0.05或P<0.01)。在雄鼠,睾丸重量、睾丸系数、附睾重量及附睾系数,各TOCP暴露组均无统计学差异(P>0.05)。(17)F3代卵巢Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的m RNA表达水平,与Control组相比,在100 mg/kg/day暴露组其表达水平显著升高(P<0.01或P<0.001),而其余TOCP暴露组与Control组相比无明显差异(P>0.05)。结论:1.妊娠期TOCP暴露,能显著抑制小鼠胎盘的生长与发育,其机制可能是通过影响胎盘细胞氧化应激、增殖、凋亡及自噬来实现。2.妊娠期TOCP暴露,能显著影响小鼠卵巢黄体的内分泌功能,其机制可能是通过影响卵巢甾体激素合成酶相关基因表达、氧化应激、凋亡及自噬来实现。3.出生前TOCP暴露,能明显影响雌性子代的生殖系统功能,其机制可能是通过改变子代卵巢组织DNA甲基化水平来实现的。