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目的：iASPP是p53凋亡诱导蛋白家族(ASPP)的一个抑制性成员,对p53的凋亡功能起负性调控作用。本研究使用实验室前期己成功建立的iASPP转基因(iASPPTg)小鼠模型,探讨iASPP过表达对造血干祖细胞(HSPC)自我更新以及抗凋亡作用的影响。内容：iASPP作为一个抗凋亡基因,在造血系统中过表达,将导致造血异常。我们实验室前期研究发现在急性白血病(AL)病人中iASPP的表达显著高于正常对照组,为了研究iASPP对正常造血的影响,实验室建立了在小鼠造血组织中特异性高表达iASPP的转基因(iASPP Tg)小鼠模型。本实验应用该小鼠模型,研究iASPP过表达对HSPC数目以及功能的影响,以及iASPP Tg小鼠中造血干细胞细胞周期改变以及细胞凋亡和损伤的情况。方法：用多色流式细胞仪分析小鼠骨髓单个核细胞(BMMNC)中各个HSPC群的比例改变；使用体内连续移植以及体外连续集落接种的方法研究iASPP Tg小鼠HSPC自我更新和造血重建潜能的改变；使用Annexin V和PI标记以及流式分析方法研究电离辐射和VP16药物处理两种凋亡诱导方式引起的iASPP Tg小鼠和野生型小鼠骨髓造血干细胞以及BMMNC的凋亡比例；使用Western blot和免疫荧光方法检测电离辐射引起的小鼠BMMNC中γ-H2AX的表达情况；使用siRNA干扰技术结合VP16药物处理检测iASPP Tg小鼠中BMMNC的抗凋亡作用对p53的依赖性；使用小鼠表达谱芯片技术分析iASPP过表达对基因表达和信号通路的影响,为后续研究iASPP的作用机制打下基础。结果：多色流式分析的结果显示,iASPP Tg小鼠中各群HSPC的比例均比野生组小鼠高：以造血干细胞、长期造血干细胞、多潜能祖细胞、共同髓系祖细胞和粒-单系祖细胞比例增加最为明显(p<0.05),而短期造血干细胞和巨核-红系祖细胞比例增加不明显(p>0.05)；体内连续移植显示iASPP Tg组各代受体小鼠体内的造血干细胞数目在1个月的时候始终高于野生组,体外连续集落形成实验也证明在第2代和第3代中,iASPP Tg组的集落数目远远超过野生组；照射和VP16处理两个实验都显示iASPP Tg小鼠骨髓造血干细胞以及BMMNC的凋亡比例明显低于野生组小鼠；Western blot和免疫荧光分析方法动态检测了照射后iASPP Tg小鼠BMMNC中的γ-H2AX的表达在不同时间点始终高于野生组；应用VP16处理时,可以看到iASPP Tg小鼠的BMMNC的凋亡比例始终低于野生组小鼠,而应用RNA干扰方法,抑制小鼠体内的p53表达后,两组小鼠BMMNC的凋亡比例没有明显差别；小鼠表达谱芯片分析显示iASPP Tg小鼠中的很多与凋亡相关、p53通路以及癌症发生相关的通路发生改变。结论：以上结果第一次证明了抗凋亡调节因子iASPP能够增加造血干/祖细胞的数目,并增强其造血重建的能力。更为有意义的是,iASPP能够保护细胞抵抗凋亡,这些受到凋亡损伤而保留下来的细胞,其细胞修复并没有相应增加,因而随着时间的推移,细胞内累积的损伤越来越多,最终将会引起基因组的不稳定,导致恶性转化,肿瘤发生。目的：急性髓系白血病(AML)病人中,NPM1突变(NPM1c+)的预后较NPM1野生型的预后好。近年,国外有临床试验报道在联合化疗中加入全反式维甲酸(ATRA), NPM1c+AML病人的预后以及生存期明显提高。本实验的目的是将突变型NPM1导入白血病细胞中,观察细胞的增殖、凋亡、周期以及对ATRA药物的反应等生物学特性,进一步探讨NPM1突变在白血病中的作用及相关机制,以及NPM1突变对ATRA的药物反应,为临床用药提供依据。方法：采用PCR方法从质粒载体GM-NPM1wt(野生型NPM1)和GM-NPM1mutA(A型突变NPM1)扩增目的片段NPM1wt和NPM1mutA,连接到MSCV-IRES-GFP逆转率病毒载体上,采用磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装病毒,感染人白血病细胞系HL-60细胞,根据绿色荧光强度筛选出GFP高表达的单克隆细胞,继而通过RQ-PCR、allel-specificPCR和Western blot筛选出目的蛋白高表达的单克隆。采用MTT法检测细胞的增殖活性。采用流式细胞仪技术检测单克隆细胞经ATRA处理后细胞周期、分化和凋亡的改变。采用甲基纤维素半固体培养基测定ATRA处理后各单克隆细胞的集落形成能力的改变。结果：成功筛选出稳定表达NPM1wt和NPM1mutA的HL-60单克隆细胞。检测这些单克隆细胞的生物学特性和对ATRA的药物反应,结果显示：(1)细胞增殖：与空载体相比,NPM1mutA没有明显改变HL-60细胞的增殖活性(p>0.05)；(2)细胞周期：与空载体相比,NPM1mutA降低细胞的G0/G1期的比例(p<0.05),增加S期的比例(p<0.05),当用ATRA处理后,这种差距更加明显(p<0.05)；(3)集落形成：NPM1mutA增强细胞的集落形成能力(p<0.05),并能够被ATRA明显抑制(p<0.05)；(4)细胞分化：NPM1mutA降低细胞的分化,且对ATRA的诱导分化具有抵抗能力(p<0.05)；(5)凋亡：NPM1mutA能稍微增加HL-60细胞的基础凋亡,但无统计学差异。当用ATRA处理3天后,NPM1mutA能够明显增加细胞的凋亡比例(p<0.05)。结论：NPM1mutA能够明显增加HL-60细胞的集落形成能力,降低HL-60细胞的基础分化。ATRA处理能明显抑制NPM1mutA的HL-60细胞的集落形成能力；NPM1mutA能够增加HL-60细胞对ATRA的凋亡敏感性,但NPM1mutA对ATRA的分化诱导具有明显的抵抗能力。因此,ATRA治疗NPM1突变的白血病细胞,可能是通过增加细胞凋亡和降低细胞增殖而发挥作用。