目的胸腔积液是肺部多种疾病的常见并发症,它也是验证疾病病因,判断其良恶性的重要媒介。大约20%的胸水由恶性肿瘤引起,恶性积液中50%是原发性肺癌。另有数据显示约30%的肺癌患者最初的临床表现是胸水。在胸腔积液中找到癌细胞是诊断恶性胸腔积液的金标准。然而,常规细胞学检查主要是依靠细胞形态进行诊断,从胸膜脱落下来的反应性间皮细胞也有“腺癌细胞”的一些形态特征,加之数量稀少、异型性不明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别,故单纯依靠细胞形态学诊断准确性甚低,敏感度仅达57.3%,特异度为89%。建立一组科学、有效的诊断方法是提高肺癌阳性诊断率的有效途径,也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。本课题以肺癌患者为研究对象,以肺癌性胸水为检测基础,采用RT-PCR方法测定癌细胞中GLUT1mRNA的基因表达;应用蛋白印迹法(Weslern blot)测定GLUT1的蛋白定量表达;探讨诊断肺癌性胸水的新指标和新的检测手段,评价这四种检测指标单一和两两联合应用诊断恶性胸水的临床应用价值。方法收集中国医科大学附属第一医院2006年4月至2006年12月门诊及住院患者100例,其中原发性肺癌56例,肺良性疾病患者44例。1、免疫细胞化学染色(1)收集胸水中细胞白膜层沉渣制备石蜡包埋块。(2)切片,应用免疫细胞化学方法(streptavidian-peroxidase,S-P)染色。检测GLUT1和HBME-1的表达情况。2、逆转录多聚酶链式反应(Rverese transcription polymerasechain reaction,RT-PCR)扩增及扩增产物的分析。(1)收集胸水中细胞白膜层沉渣提取总RNA。(2)总RNA反转录和GLUT1基因片段的扩增。(3)利用凝胶电泳分析仪观察并分析结果。3、蛋白印记(Western Blot)分析(1)测定胸水中蛋白浓度。(2)配置分离胶和浓缩胶,上样,电泳。(3)转印,封闭抗原后依次加入抗体反应。(4)DAB显色并扫描记录,分析结果。结果1、胸水内细胞GLUT1免疫细胞化学染色结果56例肺癌性胸水中有50例癌细胞GLUT1呈阳性表达,占89.3%。44例良性胸水中只有5例可见间皮细胞着色,占11.4%,两种不同性质胸水的GLUT1阳性率具有显著性差异(x~2=60.44,P＜0.01)。2、胸水内细胞HMBE-1免疫细胞化学染色结果44例良性胸水中有41例反应性间皮细胞HBME-1呈阳性表达,占93.2%。56例癌性胸水中有11例可见癌细胞着色,占19.6%。两种不同性质胸水的HBME-1阳性率具有显著性差异(x~2=53.39,P＜0.01)。3、RT-PCR法检测结果肺癌组胸水中GLUT1mRNA阳性表达率为92.8%(52/56),肺良性疾病组胸水中GLUT1mRNA阳性表达率为11.4%(5/44),两组之间GLUT1mRNA阳性表达率的差异具有统计学意义(x~2=66.76,P＜0.01);肺癌组胸水中GLUT1mRNA阳性表达率与病理分型无关(x~2=0.72,P＞0.05)。4、Western Blot检测结果肺癌组胸水中GLUT1蛋白的光密度值高于肺良性疾病组胸水,两组之间的GLUT1蛋白的表达有显著性差异(F=16.7,P＜0.01)。应用ROC曲线分析软件,绘制受试者工作特性曲线(Receiver Operator Characteristic Curve,ROC曲线),选取敏感性与特异性均比较高的最佳临界点作为正常参考值(本实验中GLUT1蛋白印记＜124.25单位),计算其诊断肺癌的敏感度、特异度分别为87.5%(49/56)、84.1%(37/44)。不同病理类型肺癌患者胸水中GLUT1蛋白阳性表达率差异无统计学意义(x~2=1.33,P＞0.05)。5、四种检测指标单一及两两联合应用对肺癌性胸水诊断效能的比较免疫细胞化学检测HBME-1和GLUT1mRNA联合应用,准确度最高,敏感度和特异性分别可达98.3%(55/56)、84.1%(37/44)。讨论葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)在上皮源性恶性肿瘤中广泛表达,目前已经报道的表达部位有:肺、乳腺、卵巢等。理论上讲,只有上皮来源的细胞才能表达GLUT1,非上皮来源的细胞不表达,因此检测GLUT1表达与否有助于确定胸水内细胞的来源。良性胸水内只存在炎症细胞和间皮细胞,没有上皮来源细胞,如果出现GLUT1表达阳性的细胞多意味着上皮性肿瘤细胞转移所致。MC(Mesothelial Cell)主要分布于间皮细胞中,胸水内的非间皮细胞不表达,由于炎症细胞在形态上完全可以辨认,故与癌细胞容易混淆的只有间皮细胞。根据MC只表达于间皮细胞而一般不表达腺上皮细胞,因此对胸水内间皮细胞与癌细胞的鉴别起到重要的作用。GLUT1是上皮细胞的分子标志,而HBME-1是间皮细胞的分子标记,两者联合应用构成一组正反互补的抗体组合,从而从正反两个方面筛查肺癌患者胸水中的癌细胞。结果显示,平行实验分析GLUT1和HBME-1的联合检测结果,确实能进一步提高诊断的效率,其敏感性和特异性分别达94.6%(53/56),81.8%(36/44)。免疫组化技术在癌细胞脱落胸腔早期阶段,癌细胞数量过少时无法采集制片进行检测,因而对胸膜微转移的早期诊断是有限的。RT-PCR技术则有效的弥补了这一不足,其通过对肺癌患者胸水中肿瘤细胞mRNA的检测,在癌细胞脱落至胸腔的早期阶段即可做出肺癌性胸水的诊断。本研究结果提示用GLUT1mRNA检测肺癌患者胸水中癌细胞既可作为重要的诊断指标,又可作为检测肺癌胸膜转移的参考指标。与固体肿瘤不同,在氧分压降低、肿瘤血管形成缺乏的条件下,体腔积液中肿瘤细胞主要依赖糖效解获能,以满足其自身代谢和增殖的需要,而GLUT1是葡萄糖跨膜转运的最主要的载体,在癌细胞脱落胸腔早期阶段,甚至癌细胞尚未脱落至胸腔内阶段,应用蛋白印迹技术可检测胸水中GLUT1的表达,以达到早期诊断的目的。本研究结果证实Western Blot方法的准确性及敏感度均超过常规细胞学方法。本研究中,应用免疫细胞化学检测GLUT1及HBME-1,RT-PCR、Western Blot检测GLUT1mRNA及GLUT1蛋白可有效提高肺癌胸水诊断的敏感度,单项检测GLUT1mRNA敏感度最高,达92.8%,应用免疫细胞化学方法单项检测HBME-1特异性最高,达93.2%。四种方法两两联合应用时,免疫细胞化学检测HBME-1和GLUT1mRNA联合应用,准确度最高,敏感度和特异性分别可达98.3%(55/56)、84.1%(37/44),对诊断肺癌性胸水有重要的临床应用价值,可作为研究早期癌细胞播散的一种重要方法,具广阔的应用前景。结论1、应用免疫细胞化学检测GLUT1及HBME-1,RT-PCR、Western Blot检测GLUT1可有效提高肺癌胸水诊断的敏感度。2、免疫细胞化学检测HBME-1和GLUT1mRNA联合应用,准确度最高,敏感度和特异性分别可达98.3%(55/56)、84.1%(37/44),对诊断肺癌性胸水有重要的临床应用价值。