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新生隐球菌是一种环境致病菌,可以感染人类和许多哺乳动物的肺部、皮肤黏膜、肝脏、骨骼等全身器官,但最常侵犯中枢神经系统,引起具有致死性威胁的隐球菌性脑膜炎。据估计,仅2014年就新增223100隐球菌性脑膜炎病例,其中73%发生在非洲[1]。与欧美、非洲等地区隐球菌性脑膜炎主要发生在AIDS人群不同的是,我国主要发生无已知免疫功能缺陷看似免疫功能正常的人群,但该人群相比免疫功能缺陷的病人治疗周期更长,更困难,给病人和社会带来的经济负担更重[2]。隐球菌性脑膜炎患者如不及时治疗,86%的人在一年内死亡,即使现代充分治疗的情况下,死亡率仍有20%-30%左右[3]。因此,如何有效防治新生隐球菌中枢神经系统感染,是我们目前急需解决的问题。THP-1细胞(人单核巨噬细胞)是人体固有免疫系统的重要组成部分,在外界因素刺激下可被激活为经典激活巨噬细胞(M1型)和替代激活巨噬细胞(M2型):M1型细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子,具有很强的杀菌作用;M2型巨噬细胞分泌转化生长因子-β(TGF-β)、精氨酸酶1(Arg1)、白细胞介素-10(IL-10)等炎症因子,可抑制炎症反应[4]。在新生隐球菌性脑膜炎患者中,M1型细胞有助于清除病原体,而M2型细胞介导免疫逃逸[5],因此促进THP-1细胞向M1型极化有助于治疗隐球菌性脑膜炎。Micro RNA(miRNA)是一类长度约为20~24 nt非编码小RNA分子,主要在转录后水平调节靶基因表达,参与细胞分化、信号转导、免疫应答、肿瘤发生等多种生命活动。miR-155-5p位于人类21号染色体上B-cell Integration Cluster(bic)基因的第三个外显子内,可通过靶向降解目的基因m RNA发挥其功能作用。有研究发现其在人肺癌、甲状腺癌、宫颈癌、胰腺癌等实体瘤中高表达,与肿瘤细胞的增殖分化相关[6];另有研究表明miR-155-5p参与免疫细胞的发育分化,在活化的巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞中表达明显增加,并在免疫应答中发挥着重要的作用[7]。IKBKE是一种编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因,是IκB激酶家族(IKKs)家族新近发现的成员,可参与肿瘤发生发展和免疫细胞的活化、增殖、分化及凋亡[8]。有研究发现其可通过调节核转录因子-κB(NF-κB)信号转导途径,在固有免疫系统中发挥重要作用[9]。通过前期mirnada网站预测,我们发现miR-155-5p和IKBKE基因有结合位点,而miR-155-5p和IKBKE基因均参与细胞炎症反应,因此我们猜测miR-155-5p通过靶向降解IKBKE m RNA在THP-1细胞抗新生隐球菌免疫反应中发挥着作用。一、新生隐球菌诱导THP-1细胞后miR155-5p、IKBKE、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化更换细胞液,调整好THP-1细胞的生长状态,加入PMA将细胞分化为巨噬细胞,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入细胞培养瓶中,分别干预0h、3h、6h、9h、12h,取各自时间点的上清和细胞,保存于-80℃冰箱。将上清解冻,用酶联免疫吸附法(Elisa)测定上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量;用Trizol法提取细胞RNA,用实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)测定miR155-5p和IKBKE的表达倍数变化。我们研究发现在新生隐球菌干预下,THP-1细胞中miR-155-5p表达增加,其中在6h达到峰值,IKBKE含量降低,在3h、6h、9h有统计学差异,TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量随时间明显增加。二、双荧光素酶报告系统验证miR-155-5p和IKBKE的靶向关系根据mirnada网站预测结果,miR-155-5p可靶向降解IKBKE m RNA,为了进一步验证该靶向关系,我们进行了双荧光素酶报告实验:将实验分为6组,分别是海肾荧光素酶(p RL)质粒+mimics NC、p RL质粒+miR-155-5p、p RL质粒+IKBKE 3’UTR+mimics NC、p RL质粒+IKBKE 3’UTR+miR-155-5p、p RL质粒+IKBKE 3’UTRmut+mimics NC、p RL质粒+IKBKE 3’UTR-mut+mimics NC。将生长良好的细胞分入24-well培养板培养,根据分组转染质粒。24h后使用荧光显微镜观察目的荧光标记基因的表达情况,然后使用“Dual-Luciferase?Reporter Assay System(E1910,promega)”试剂盒处理细胞、进行荧光素酶表达检测。我们研究发现实验组较对照组荧光值降低了30%,表明miR-155-5p可靶向降解IKBKE m RNA 3’UTR,而将IKBKE 3’UTR突变后,其活性较野生型增加了15%,表明该结合位点对miR-155-5p和IKBKE的功能发挥比较重要。三、验证miR-155-5p对IKBKE、TNF-α、IL-1β和IL-6表达的调控作用更换细胞液,调整好THP-1细胞的生长状态,加入PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。将实验分为4组,分别是分别是0h对照组、6h对照组、0h mimics组、6h mimics组,用Lipofectamine 2000试剂盒,按照试剂盒操作步骤进行操作。各组按照5:1比例加入热灭活新生隐球菌,同时实验组转染miR-155-5p mimics,对照组转染miR-155-5p mimics对照物,检测转染效率,提取RNA和上清进行q PCR和Elisa实验,检测IKBKE、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量。我们研究发现实验组及对照组在6h miR-155-5p表达均增加,实验组增加更加明显,有统计学差异,表明转染成功;IKIBKE的表达在6h均下降,实验组下降更加明显,有统计学差异,表明miR-155-5p可靶向降解IKBKE m RNA;TNF-α、IL-1β和IL-6各组在6h均表达增加,实验组增加更加明显,有统计学差异,表明miR-155-5p的表达上调可促进TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。四、IKBKE si RNA转染THP-1细胞后TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化更换细胞液,调整好细胞生长状态,加入PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,用不含抗生素和血清的培养基稀释IKBKE si RNA。将实验分为空白对照组和转染IKBKE si RNA组,按照5:1比例各组加入热灭活新生隐球菌,同时实验组转染IKBKE si RNA,对照组转染其对照物,提取RNA及上清进行q PCR和Elisa实验,检测IKBKE、TNF-α、IL-1β和L-6的表达变化。我们研究发现各组IKBKE表达均在6h下降,且实验组下降更加明显,差异有统计学意义,表明转染IKBKE si RNA成功;TNF-α、IL-1β和L-6在6h表达均增加,且实验组增加更加明显,差异有统计学意义,表明IKBKE表达降低可以促进TNF-α、IL-1β和L-6的表达。综合以上研究,我们发现miR-155-5p和IKBKE有结合位点,且可以靶向降解IKBKE m RNA,进而促进TNF-α、IL-1β和L-6的表达。根据已有研究结果表明,TNF-α、IL-1β和L-6为M1型巨噬细胞分泌的炎症因子,该细胞为促炎类型的巨噬细胞,具有强效杀菌特点并促进辅助性T细胞1型参与的免疫反应(Th1型免疫反应),其在隐球菌性脑膜炎病程中发挥着抗感染杀菌的作用[5]。因此miR-155-5p可作为隐球菌性脑膜炎的潜在的治疗靶点,在临床实践中发挥着重要作用。