甜菜BvCBL全基因组鉴定及BvSOS1和BvSOS3的抗逆性研究

来源 :兰州理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lahlyg
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植物生长发育过程中通常会遇到各种不利其生长的环境,如盐碱、干旱、极端温度、缺K+以及病虫害等,这些逆境是严重制约世界作物生长和生产力的重要影响因素。植物不能移动无法逃离这些逆境,只能主动地接受。因此,植物在长期的演变过程中演化出精准的信号转导机制和相互作用调控网络,感应和转导多变的外界信号,从而对逆境及时做出应激反应。SOS(Salt overly sensitive)通路就是响应盐胁迫的重要途径之一。SOS通路中的三个重要成员(SOS1、SOS2和SOS3)相互作用,启动磷酸化级联反应,释放细胞内过量的Na+到外界,从而降低盐胁迫对细胞造成的毒性,因此SOS途径在保持植物细胞内K+/Na+的平衡,减少细胞乃至植物体内Na+的聚积中有重要作用。因此,克隆甜菜SOS通路的关键基因并对其进行功能研究变得非常有必要。本论文研究以甜菜(Beta vulgaris L.)为研究对象,在基因组水平上挖掘和鉴定钙调磷酸酶B样蛋白(Calcineurin B-like protein)BvCBLs基因家族;利用qRT-PCR分析其在盐和干旱胁迫下的表达模式。此外,克隆BvCBL1(BvSOS3)和质膜Na+/H+逆向转运蛋白BvSOS1全长cDNA,并构建pEarley Gate 100-BvSOS1/3超表达载体,遗传转化拟南芥并验证BvSOS1/3的耐盐性。主要取得如下结果:(1)在甜菜基因组中鉴定出7个BvCBLs基因。系统发育将BvCBLs可分为四组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组),所有BvCBLs均含有保守的EF-hand基序,而BvCBL1、BvCBL2和BvCBL5的N-末端则含有豆蔻酰化位点,BvCBL4和BvCBL6的N端包含一个跨膜结构域。预测的BvCBLs与多个CIPKs相互作用。另外,qRT-PCR结果表明,在50 mmol/L NaCl处理下,BvCBLs在地上部和根部的表达量均有显著增加,而在山梨醇处理下,BvCBLs在根部的表达量被显著诱导。这些结果表明,BvCBLs可能在甜菜响应盐和干旱中发挥重要作用。(2)根据甜菜基因组库中的序列设计引物,从甜菜中克隆到了BvSOS3(BvCBL1)和质膜Na+/H+逆向转运基因BvSOS1。BvSOS1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)为3489 bp,编码1126个氨基酸,BvSOS3 ORF为660bp,编码219个氨基酸,均为属亲水性蛋白。将甜菜BvSOS1/3目的片段克隆至过表达载体pEarley Gate 100中,经菌液PCR、酶切和测序鉴定后,将鉴定完全正确的两个pEarley Gate 100-BvSOS1/3超表达载体,转入农杆菌GV3101感受态。用花侵染法将带有BvSOS1/3基因片段的过表达载体转化到拟南芥基因组,以获取T1代种子,并用Basta抗性筛选到T3代阳性纯合植株,进而验证BvSOS1/3的抗逆性功能。(3)经Basta筛选得到的BvSOS1/3转基因植株用基因组PCR、测序和qRT-PCR确定BvSOS1/3基因转入拟南芥,获得BvSOS1/3转基因阳性株系。转基因植株中的BvSOS1/3表达明显高出野生型4000-15000倍。T3代纯合植株种子用150 mmol/L NaCl和0.5μmol/L ABA处理后,BvSOS1/3超表达株系的种子萌发率显著高于野生型。BvSOS1/3转基因阳性植株用75和150 mmol/L NaCl处理后,其根长、鲜重、脯氨酸和叶绿素含量等生理参数及响应逆境基因(脯氨酸合成酶基因AtP5CS1和抗氧化酶相关基因AtSOD1、AtCAT1、AtPOD1)的表达水平均显著增加,表明拟南芥中过表达BvSOS1/3基因可增强植株的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而提高植物对盐的适应能力。综上所述,本论文在甜菜CBL家族成员的鉴定和胁迫处理下表达模式分析的基础上,结合BvSOS1和BvSOS3(BvCBL1)基因在拟南芥超表达,以验证甜菜SOS通路的响应盐胁迫机制。以期为改良农作物抗逆性提供遗传资源和理论基础。
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