基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA及分子识别文库的构建

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1、基于发卡DNA自组装金胶比色检测DNA  DNA是生物体内的遗传分子,DNA的检测通常与各种疾病的诊断相关,因此DNA检测具有重要的研究意义。目前由于DNA检测技术的不断进步,人们对其他生物分子如蛋白质、小分子物质的检测也可以转化为对DNA的检测。DNA检测的方法很多,比如纳米金比色检测、荧光分析检测、化学发光检测、比色检测、电化学检测和荧光定量PCR等。鉴于纳米金比色检测的简单、肉眼可见等优点,本课题提出了基于发卡DNA催化自组装及目标循环放大的方法比色检测DNA。  实验中设计两条发卡DNA探针H1、H2,当目标DNA不存在时,发卡DNA形成稳定的茎环结构。当加入目标DNA之后,目标DNA将H1链的茎环结构打开,H1链又会将打开H2链的茎环结构,两者形成互补结构,同时目标DNA被替换下来并引发下一轮的链置换反应从而实现信号放大,末端修饰金纳米颗粒的H1、H2链互补后使金胶颗粒间距减小,金胶发生聚沉并产生肉眼可见的颜色变化。  该方法操作简单、灵敏度高、费用低,不需要借助大型仪器便可直接用肉眼观察实验结果。实验条件下.检测到目标DNA的最低浓度为2.2nM,而且该实验方法对于目标DNA的检测信号远大于发生碱基错配的DNA的检测信号,因此选择性良好。  2、蛋白质分子识别文库的构建  生物分子识别元件是生物传感器主要组成部分。寻找多样的生物分子识别元件是生物传感器的重要发展方向之一。在此部分,我们主要利用组合基因模块的定向进化方法来构建多样性的基因文库,寻找新型的蛋白质识别分子。  为便于筛选,本实验以卡那霉素抗性基因作为识别分子来验证识别文库构建方法的有效性。首先从GeneBank中查询卡那霉素抗性基因序列并进行结构域分析,根据二级结构设计基因片段进行基因重组。首先进行一系列基因重组条件的优化,然后将重组基因大量扩增并连接,转化入大肠杆菌体内,最后筛选得到了不同长度的重组基因片段,随机挑选阳性克隆进行测序,测序结果显示不同基因片段之间同源性较低,组合变化较多,达到实验的预期目标。此方法的创建必将对难以找到识别分子的检测目标,如新的靶点受体的筛选,预防和治疗新发现的病毒等发挥积极的作用。
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