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氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans的细胞膜上存在众多脱氢酶,可将多羟基底物氧化成对应的醛、酮、酸,并直接分泌到培养基中。细胞膜结合的葡萄糖代谢酶系具有底物特异性和不完全氧化性,这种独特的不完全氧化性质可将葡萄糖转化成D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、5-酮基-D-葡萄糖酸等化合物。D-葡萄糖酸是化学、医学及食品等产品的重要中间体,市场需求量较大,促使人们不断研究和改进D-葡萄糖酸的生产工艺。由于氧化葡萄糖杆菌具有耐酸、耐高浓度葡萄糖的特点,与工业上广泛采用的黑曲霉发酵法相比,利用氧化葡萄糖杆菌进行D-葡萄糖酸制备,具有环境污染小和生产工艺简单的优势。本研究对从花朵中分离到的一株G.oxydans DHA3-9进行了葡萄糖氧化杆菌的D-葡萄糖酸转化工艺的可行性探索及D-葡萄糖代谢酶系研究,主要结果如下：1.菌株DHA3-9的D-葡萄糖酸脱氢酶基因(gadH)的克隆与敲除：通过PCR得到D-葡萄糖酸脱氢酶基因gadH的部分序列,通过DNA序列比对显示该酶与G.oxydans621H的D-葡萄糖酸脱氢酶相似度为85%。采用同源重组的方法将DHA3-9的gadH成功敲除,使菌株不再积累2-酮基-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate,2KGA)。2.菌株DHA-△gadH的高浓度D-葡萄糖酸转化：用无CaCO3的葡萄糖培养基培养DHA3-9能够显著降低副产物5-酮基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconate,5KGA)的积累量,并利用该培养基在高浓度初始葡萄糖下培养DHA-AgadH,于30℃连续培养72h,最终D-葡萄糖酸产量达142.25g/L,但仍有50%葡萄糖未被转化,未来可通过优化发酵条件获得更高的葡萄糖酸产率和葡萄糖利用率。3.菌株DHA3-9的膜结合D-葡萄糖脱氢酶基因(mgdH)的克隆与敲除：通过PCR得到D-葡萄糖脱氢酶基因mgdH的部分序列,通过DNA序列比对显示该酶与G.oxydans621H的D-葡萄糖脱氢酶相似度为97%。采用同源重组的方法将DHA3-9的mgdH成功敲除,使菌株转化D-葡萄糖酸的能力降低98%。4.菌株DHA-AmgdH的葡萄糖代谢酶系研究：野生菌DHA3-9与突变菌△mgdH的葡萄糖代谢产物经离子色谱分析表明,△mgdH代谢产物中丙酮酸和二羟基丙酮浓度增加且检测到野生菌代谢产物中没有的乙酸。高浓度乙酸可显著抑制突变菌△mgdH的葡萄糖代谢。结果表明,突变菌△mgdH主要通过另一条途径进行葡萄糖代谢,即糖酵解(EMP)途径将葡萄糖转化为乙酸。