肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及病死率位居各类型肿瘤的前列。而根据我国最新的恶性肿瘤发病与死亡分析,肝癌的发病率排在第三位,其死亡率在男性、女性中分位列排第二位和第三位。更令人警惕的是,中国的新发病例数及死亡病例数占据了全球数据的50%左右。由此可见,我国是名副其实的肝癌"大国"。当前,肝癌的治疗主要采用以外科手术为主的综合治疗手段,而在接受首次根治性治疗后,术后复发始终是阻碍肝癌患者长期、高质量生存的主要问题,这种复发包括肿瘤的再发和转移。当今,中医药在防治肿瘤术后复发上得到越来越多的运用,尤其在提高肿瘤患者的生存质量和延长生存时间上拥有较大优势。其中,健脾化瘀方是吸收了名老中医钱伯文教授的临床经验,结合一系列实验研究调整、优化而成的,运用于肝癌术后的经验用方,具有健脾益气、理气化湿、化瘀散结、清热解毒的功效,善于祛邪扶正、攻补兼施。因此,进一步深入研究其明确的抗肿瘤机制显得更具意义。根据本课题组前期已在细胞水平上验证了 miRNA-570(以下简写为miR-570)与B7-H1/PD-1通路之间的负反馈调节机制,我们现在进一步推测健脾化瘀方能在肝癌术后的裸鼠体内通过介导miR-570的表达来调控B7-H1/PD-1通路的激活与失活,从而干预肝癌术后肿瘤复发与休眠的转归。本研究以分别接种了人源肝癌细胞SMMC-7721及过表达miR-570的肝癌细胞的肝原位移植瘤裸鼠模型作为基础,进一步通过手术切除构建肝癌术后复发/休眠的裸鼠模型,运用小动物PET/CT影像学检查、病理学检查、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术等技术,验证了肝癌术后miR-570与B7-H1/PD-1通路的体内作用机制。另一部分,以肝癌术后复发/休眠裸鼠模型作为研究对象,分别给予健脾化瘀方、5-氟尿嘧啶进行干预,运用小动物PET/CT影像学检查、病理学检查、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术等技术,观察并佐证了健脾化瘀方对肝癌术后复发的防治作用,并探讨了其中的内在机制。目的:通过体内研究明确肝癌术后miR-570调控B7-H1/PD-1通路对术后复发/休眠的转归作用及其机制,探讨健脾化瘀方通过介导miR-570的表达调控B7-H1/PD-1通路防治肝癌术后复发的作用机制。方法:首先,通过慢病毒转染技术及稳定性筛选,构建了过表达miR-570的人源肝癌细胞株SMCC-7721。常规培养SMMC-7721细胞及miR-570稳定筛选的SMMC-7721细胞,分别接种于成年雄性裸鼠的肝脏上,以建立肝原位移植瘤裸鼠模型。观察原位成瘤后,进一步通过手术切除建立肝原位癌术后裸鼠模型。随后予连续外伤刺激以诱导裸鼠肝癌术后复发,期间观察并记录裸鼠一般情况、肿瘤生长情况,通过运用小动物PET/CT影像学检查、病理学检查来评估肿瘤复发情况,qRT-PCR、Western blot等技术检测miR-570、B7-H1的表达水平,流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群表达情况。另一方面,以建立肝原位癌术后裸鼠模型为研究对象,分别予健脾化瘀方、5-氟尿嘧啶进行干预,观察并记录裸鼠一般情况、肿瘤生长情况,运用小动物PET/CT影像学检测、病理学检验来评估肿瘤的复发情况,qRT-PCR、Western blot等技术检测miR-570、B7-H1的表达水平,流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群表达情况。结果:1.miR-570对肝癌术后复发的抑制作用:(1)实验结束后各组裸鼠全部存活,全程均未见瘤体组织突出腹部表面生长。在术后第24天可见阴性对照组(以下称NC组)有5只裸鼠出现体重明显下降、弓背、行动迟缓、运动耐力变差等恶病质表现,并观察到有2只裸鼠出现头面部可疑肿物;而miR-570组未见裸鼠出现恶病质表现及生长在其他部位的可疑肿物。(2)两组裸鼠在瘤块切除后做连续外伤刺激诱导复发,并行小动物PET/CT影像学检查,可分别在左、中上腹发现团状高摄取区域,其中NC组的高摄取区域范围较miR-570组明显增大。(3)病理学检查结果提示:NC组有13只裸鼠在肝脏发生肿瘤复发,其中有3只裸鼠在腹腔中可见散在癌结节,腹膜上可见癌细胞,有2只出现肺部或肺部淋巴结肿瘤转移,有2只出现头面部转移;其他组织器官未见肿瘤细胞。而miR-570组有8只裸鼠在肝脏发生肿瘤复发,其他组织器官未见肿瘤细胞。根据病理学检查结果,miR-570组相较于NC组,其复发率有所下降,但统计学未提示显著差异(P>0.05),但两组间仍存在不同程度脏器转移,miR-570组的转移灶数量显著减少(P<0.01)。2.在肝癌术后状态下miR-570与B7-H1/PD-1通路的负性调控机制:qRT-PCR检测两组中miRNA-570的表达情况,miR-570组中miR-570表达有明显升高(p<0.01),而Western blot检测两组中B7-H1的表达情况,miR-570组中B7-H1的表达相较于NC组明显降低(p<0.01),最后流式细胞术结果提示,miR-570组的T淋巴细胞亚型发生明显改变,CD4+细胞水平、CD4+/CD8+比值明显升高(p<0.01),CD8+细胞水平明显下降(p<0.01)。3.健脾化瘀方对肝癌术后复发的防治作用:(1)实验结束后各组裸鼠全部存活,全程均未见瘤体组织突出腹部体表生长。给药后第24天可见NC组、5-FU组、健脾化瘀方组分别有5只、3只、1只裸鼠出现体重明显下降、弓背、行动迟缓、运动耐力变差等恶病质表现;NC组有2只裸鼠观察到头面部有可疑肿物;给药后第26天可见5-FU组有2只裸鼠恶病质表现进一步加重,体重大幅度减轻,纳食差等。(2)三组裸鼠在肝癌瘤块切除后做连续外伤刺激诱导复发,5-FU组、健脾化瘀方组分别给予5-氟尿嘧啶、健脾化瘀方进行干预,并行小动物PET/CT影像学检查,可分别在中、上腹发现团状高摄取区域。(3)病理学检查结果提示:NC组中有13只裸鼠在肝脏发生肿瘤再发,其中有3只在腹腔中可见散在癌结节,腹膜上可见癌细胞,有2只出现肺部或肺部淋巴结转移,有2只出现头面部转移瘤;其他组织器官未见肿瘤细胞。5-FU组有9只裸鼠在肝脏发生肿瘤复发,其中有2只在腹腔中可见散在癌结节,腹膜上可见癌细胞,有1只出现肺部淋巴结转移,其余组织器官未见肿瘤细胞。而健脾化瘀方组有10只裸鼠在肝脏发生肿瘤再发,其中有1只裸鼠在腹腔中可见散在癌结节,腹膜上可见癌细胞,其余组织器官未见肿瘤细胞。通过病理学检查,5-FU组、健脾化瘀方组的复发率、转移灶数量总体上有所减少,但三组总体比较下未提示明显差异(P>0.05,P>0.05);其中健脾化瘀方组与NC组之间的转移灶数量两两比较,提示健脾化瘀方组有显著降低(P<0.05);与5-FU组相比,健脾化瘀方组的转移灶数量更低,但两两比较间不存在明显的差异(P>0.05)。4.健脾化瘀方对miRNA-570、B7-H1表达的干预作用:qRT-PCR检测三组中miRNA-570的表达情况,NC组与5-FU组、健脾化瘀方组之间的miRNA-570的表达情况总体存在显著差异(P<0.01),其中健脾化瘀方组和5-FU组的表达皆明显高于NC组(p<0.01,p<0.01),但健脾化瘀方组与5-FU组间的差异无统计学意义(p>0.05)。Western blot检测三组中B7-H1的表达情况,三组间B7-H1的表达情况总体存在显著差异(P<0.01),健脾化瘀方组与5-FU组的B7-H1表达皆明显降低,其中5-FU组的表达降低更为显著。结论:肝癌术后状态下miR-570与B7-H1/PD-1通路成负性反馈机制,健脾化瘀方能够通过上调miR-570,来抑制B7-H1/PD-1通路,促进肝癌向休眠转归,从而达到防治肝癌术后复发的作用。