黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)主要是由寄生曲霉(Aspergillus.parasiticus)和产毒黄曲霉(A.flavus)产生的有毒次生代谢产物，是目前发现的毒性最大的真菌毒素，广泛存在于各种食品和饲料中，严重威胁人类和动物的生命安全。为了降低AFBI对人类和动物的危害，世界各国不断制定尽可能低的食品和饲料中AFB1的限量标准，并通过检验检疫机构进行监测。目前AFB1的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐，已无法满足现场快速检测的要求。 因此，建立一种方便、简易、快速的AFB1检测方法非常重要和必要。本研究以单克隆抗体和胶体金标记技术为基础，根据竞争抑制原理，建立了黄曲霉毒素B1的金标免疫斑点检测方法，主要研究结果如下： 1、抗AFB1单克隆抗体的制备与纯化 采用体内培养法，将能够稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F8接种于BALB/c小鼠腹腔，106个/只，共接种5只，获得30mL腹水抗体。通过亲和层析法纯化，5mL亲和层析柱，每次可获得2.80mg高纯度的抗AFB1单克隆抗体。采用ELISA法分析抗体免疫活性，结果表明，纯化前后抗体效价无明显变化，比效价有所提高。 2、胶体金及免疫金探针的制备 采用柠檬酸三钠还原法，成功制备20nm胶体金溶胶。此基础上建立了抗AFB1单克隆抗体的胶体金标记条件：最佳标记pH值为7.5，最佳标记量为15μg抗AFB1单克隆抗体/mL胶体金。采用ELISA方法分析了免疫金探针活性，结果表明，标记前后抗体效价无明显变化。 3、黄曲霉毒素B1金标免疫斑点检测方法的建立 根据竞争抑制原理，以金标抗AFB1单克隆抗体作为分析探针，AFB1完全抗原AFB1-cBSA偶联物作为包被抗原，羊抗鼠IgG为质控点，初步建立了AFB1的金标免疫斑点检测体系(dotimmunogoldassay,DIGA)。当包被抗原浓度为10μg/mL，免疫金探针为原液时，肉眼判定AFB1检测限为10ng/mL，检测时间为10min左右。该方法对AFG1和AFG2特异性良好，与AFB2有较明显的交叉反应。 4、黄曲霉毒素B1的加标回收 将5种不同浓度(2.5、5、10、20、40ng/mL)的AFB1添加到不含AFB1的大米粉中，混匀，制备不同污染程度的样品。分析比较DIGA法和ELISA法对AFB1的回收情况。当添加的AFB1浓度低于10ng/mL时，有红色斑点形成，高于10ng/mL时，无红色斑点出现，同时以ELISA方法做平行实验，其回收率较高。