SH3GL2基因在喉癌中的功能及调控机制的研究喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，98％为喉鳞状细胞癌，严重影响患者的身心健康。其发病率呈逐年上升趋势，我国东北地区为高发。喉癌发生的病理分子机制仍不清楚。探讨其发生、发展的分子机制无论对喉癌的早期诊断，还是有效治疗都具有重要意义。在前期实验中，我室率先采用比较基因组杂交的方法对喉癌基因组DNA进行了分析，研究发现9p22-23存在较高频率的丢失。随后又首次采用基因芯片的方法检测在喉癌发生发展不同阶段mRNA表达的差异，发现定位于9p22的SH3GL2(SH3-domain GRB2-like 2)基因，在喉癌不同阶段的组织中均存在明显下调。此后，为了明确SH3GL2基因与喉癌的相关性，我们应用荧光定量PCR、免疫组化和Western blot方法检测了SH3GL2基因在喉癌中的表达情况，结果显示该基因在mRNA和蛋白质水平存在协调一致的表达下调，提示该基因参与了喉癌的发生发展进程，可能为喉癌一个新的肿瘤抑制基因。因此，深入研究SH3GL2基因的功能及其在信号传导通路中的调控机制为阐明喉癌发生、进展以侵袭转移的分子机理和寻找喉癌新的分子标志物均有十分重要的意义。方法应用真核表达载体和特异性siRNA转染得到SH3GL2基因高表达和低表达的Hep2细胞模型，检测SH3GL2基因表达异常对Hep2细胞的增殖能力、凋亡情况和侵袭能力等生物学性状的影响，进一步了解SH3GL2基因在喉癌发生中可能发挥的作用。构建SH3GL2基因的转基因小鼠以进一步研究该基因在生物体内的作用及建立小鼠抗肿瘤模型。通过荧光报告基因分析SH3GL2基因5′旁侧序列，以确定SH3GL2基因启动子区和调控元件。应用EMSA和免疫共沉淀等技术进一步研究该基因的上下游调控机制和其可能在细胞信号转导通路中的位置。结果1、真核表达载体构建及转染成功地构建了SH3GL2基因真核表达载体并转染喉癌Hep2细胞系，通过RT-PCR和Western blot验证得到了SH3GL2基因高表达的Hep2细胞模型。2、特异性siRNA合成及转染成功地设计并合成了SH3GL2基因特异性的siRNA并转染喉癌Hep2细胞系，通过RT-PCR和Western blot验证得到了SH3GL2基因低表达的Hep2细胞模型。3、细胞增殖能力的检测应用MTT法分别检测了SH3GL2基因高表达和低表达的Hep2细胞模型，发现在SH3GL2基因高表达时实验组细胞的增殖能力下降明显(P＜0.05)，而低表达时增殖能力升高(P＜0.05)。4、细胞凋亡水平的检测应用Anexin V和PI双标法通过流式细胞仪检测了SH3GL2基因高表达和低表达的Hep2细胞模型，发现在SH3GL2基因高表达时实验组细胞的凋亡水平有明显提升(P＜0.05)，而低表达时则有一定程度的降低(P＜0.05)。5、细胞侵袭能力的检测应用Transwell小室检测SH3GL2基因高表达和低表达对喉癌侵袭能力的影响，发现在SH3GL2基因高表达时实验组细胞的侵袭能力有明显降低(P＜0.05)，而低表达时无明显变化(P＞0.05)。6、转基因小鼠的构建和鉴定构建SH3GL2基因转基因小鼠，应用PCR和Southern blot方法鉴定并获得7只F0代小鼠。7、SH3GL2基因启动子区的克隆及活性分析分析克隆并定位SH3GL2基因5′旁侧序列。通过荧光素酶报告基因系统确定SH3GL2基因启动子的范围，并发现SH3GL2基因5′旁侧序列中2个具有明显调控作用的区域。应用EMSA实验证实NF-κB与SH3GL2基因5′旁侧序列特异性结合。8、免疫沉淀实验发现SH3GL2相互作用蛋白通过免疫沉淀发现有两个蛋白质与SH3GL2相互作用，其中一个明确为SP100蛋白。9、SP100基因和SH3GL2基因表达改变对ETS-1基因表达的影响SP100基因表达下调时，ETS-1基因的表达也同时下调；而当SH2GL2基因表达升高时，ETS-1基因的表达也呈现降低趋势(P＜0.05)。结论1、我们首次证实SH3GL2基因与喉鳞痛相关，并在喉癌组织中表达下调。2、我们首次证实SH3GL2基因对喉癌Hep2细胞多种重要的生物学行为如增殖能力、凋亡和侵袭能力有调节作用，可能是喉癌一个潜在的肿瘤抑制基因。3、构建并鉴定得到了F0代SH3GL2基因转基因小鼠。4、确定SH3GL2基因启动子的范围，并明确SH3GL2基因5′旁侧序列2个具有明显调控作用的区域。5、证实NF-κB与SH3GL2基因5′旁侧序列结合的特异性。6、应用免疫共沉淀结合质谱技术，首次发现了SH3GL2与SP100相互作用行使功能。7、我们还发现了SH2GL2基因可能通过SP100基因参与调节ETS-1基因。