目的胸腔积液是肺部多种疾病的常见并发症,它也是验证疾病病因,判断其良恶性的重要媒介。大约20%的胸腔积液是由恶性肿瘤引起,其中的50%又为原发性肺癌。约30%的肺癌患者最初的临床表现是胸腔积液,而细胞病理学是诊断恶性胸腔积液的标准方法。肺癌病灶浸破脏层胸膜,常引起胸腔积液,癌细胞可同时或随后脱入胸腔内,形成胸腔脱落癌细胞。一旦误诊,发展为胸膜转移多在短期内死亡。目前在临床上尚未发现检测原发性肺癌的公认指标。常规的细胞学检查主要是依靠癌细胞的形态特点进行诊断。由于癌细胞在积液中无组织及器官构架的束缚而自由漂浮和增生甚至经几代繁殖,失去了原来在组织中的形态特征,故单纯依靠形态学进行诊断敏感性较低,尤其是较早期异型性不太明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别,以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。建立一组科学、有效的诊断方法是提高肺癌诊断阳性率的有效途径,也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。本课题以目前国内外死亡率较高的肺癌为主攻对象,以肺癌患者的胸腔积液为检测基础,采用RT-PCR法测定癌细胞中TTF-1mRNA的表达;采用免疫细胞化学法测定TTF-1和HBME-1在癌细胞和间皮细胞的定位表达;探讨诊断以及鉴别诊断原发性肺癌性胸腔积液的新途径,评价这几种指标单一和联合应用对肺癌性胸腔积液的临床应用价值。方法收集中国医科大学附属第一医院2006年4月至2006年11月门诊及住院患者胸腔积液105例,其中:原发性肺癌51例,继发性肺癌10例以及肺良性疾病患者44例。1、免疫细胞化学染色(1)收集胸腔积液中细胞沉渣制作石蜡块。(2)切片,应用免疫细胞化学方法(streptavidin-peroxidase,S-P)染色。检测TTF-1和HBME-1的表达情况。2、逆转录多聚酶链式反应(Reverese transcription polymerase chainreaction,RT-PCR)扩增及扩增产物的分析(1)收集胸腔积液中细胞沉渣提取总RNA。(2)总RNA的反转录及TTF-1基因片段的扩增。(3)利用凝胶分析仪观察并分析结果。结果1、免疫细胞化学检测TTF-1在51例原发性肺癌患者胸腔积液中有40例呈阳性表达,占78.4%。间皮细胞、淋巴细胞、粒细胞均不着色。10例继发性肺癌胸腔积液和44例良性肺疾病胸腔积液中无一例阳性表达。2、免疫细胞化学检测HBME-1在良性胸腔积液中的阳性率为95.5%(42/44)明显高于原发性肺癌组(25.5%,13/51)和继发性肺癌组(20%,2/10)。(与原发性肺癌组比较x~2=47.43,P＜0.005,与继发性肺癌组比较x~2=25.95,P＜0.005)。3、RT-PCR检测原发性肺癌组胸腔积液中TTF-1mRNA阳性表达率为80.4%(41/51),继发性肺癌组胸腔积液为0%(0/10),肺良性疾病组胸腔积液为0%(0/44)。4、三种检测指标单一及两两联合应用对肺癌性胸腔积液诊断效能的比较,其中RT-PCR检测TTF-1mRNA与免疫细胞化学检测HBME-1联合应用有着最好的敏感度和特异度,分别为98.4%(60/61)、95.5%(42/44)。讨论甲状腺转录因子1(Thyroid Transcription Factor 1,TTF-1)是一种组织特异性核转录因子,其分子量为38KDa,选择性的表达于Ⅱ型肺泡细胞、细支气管上皮细胞、甲状腺滤泡细胞、甲状腺滤泡旁C细胞和胚胎时期间脑等区域。鉴于TTF-1特异的表达于肺癌和甲状腺癌,且甲状腺癌伴发胸腔积液者甚少,因此TTF-1是目前被发现检测原发性肺癌性胸腔积液较为理想的一种肿瘤标志物。理论上讲,只有上皮来源的细胞才能表达TTF-1,非上皮来源的细胞不表达,因此检测TTF-1表达与否有助于确定胸水内细胞的来源。良性胸腔积液内一般只存在炎症细胞和间皮细胞,没有上皮来源细胞,如果出现TTF-1表达阳性的细胞多意味着上皮性肿瘤细胞转移所致。近年来研究发现,免疫细胞化学染色似乎对解决这一问题有较大的价值,能辅助肺癌患者胸腔积液的细胞学诊断。TTF-1是上皮细胞的分子标记,HBME-1是间皮细胞的分子标记,两者联合应用构成一组正反互补单克隆抗体组,从正反两个方面筛查肺癌患者胸腔积液中的癌细胞。结果显示,平行实验分析TTF-1和HBME-1的检测结果,确实能进一步提高诊断的效率,其敏感性和特异性可分别高达96.7%和95.5%。临床上约50%的恶性胸腔积液都是由原发性肺癌引起的。而约有6%-15%的恶性胸腔积液不能确定原发部位。这就给临床上对疾病的进一步治疗、肿瘤分期以及预后判断造成了巨大的困难。本研究中,51例原发性肺癌中有40例TTF-1免疫细胞化学染色呈阳性,而10例继发性肺癌无一例呈阳性表达。该结果进一步验证了通过检测TTF-1有助于区分肿瘤是否为肺源性。原发性肺癌患者胸腔积液中腺癌细胞与鳞癌细胞的鉴别是常规细胞学检查的另一难点。本研究中,在不同病理类型原发性肺癌患者胸腔积液中,TTF-1的阳性率在腺癌组为90.7%,明显高于鳞癌组12.5%(x~2=19.98,P＜0.005)。由此可见,通过免疫细胞化学方法检测胸腔积液中细胞核内TTF-1的表达情况,还可作为肺腺癌和肺鳞癌鉴别诊断的参考指标。采用RT-PCR技术检测胸腔积液内的微转移癌细胞,可以达到早期诊断目的。该方法具有较高的敏感度,可在10~6～10~7个细胞中检测到1个目标细胞。本结果提示用RT-PCR法检测肺癌患者胸腔积液癌细胞内TTF-1mRNA,既可以作为检测肺癌胸膜转移的参考指标,又可鉴别诊断引发恶性胸腔积液的肿瘤是否为肺源性。本研究中,应用免疫细胞化学检测TTF-1及HBME-1,RT-PCR检测TTF-1mRNA可有效的提高肺癌性胸腔积液诊断的敏感度,三种检测指标两两联合应用时,RT-PCR检测TTF-1mRNA与免疫细胞化学检测HBME-1联合应用可获得最佳敏感度和特异度分别为98.4%(60/61)、95.5%(42/44),这两种方法的联合应用在保证诊断特异度的同时,充分的提高了诊断的敏感度,对诊断肺癌性胸腔积液有重要的临床价值,可作为研究早期癌细胞播散的一种重要方法,具有广泛的应用前景。结论1、应用免疫细胞化学法检测TTF-1及HBME-1,应用RT-PCR法检测TTF-1mRNA可以诊断及鉴别诊断原发性肺癌性胸腔积液。2、免疫细胞化学法检测HBME-1与RT-PCR法检测TTF-1mRNA联合应用其敏感度和特异度分别高达98.4%、95.5%,即在特异度较理想的情况下,可提高肺癌性胸腔积液诊断的敏感度。3、应用免疫细胞化学及RT-PCR检测TTF-1还可作为不同病理学类型肺癌性胸腔积液鉴别诊断的参考指标。