目的:明确艾灸促进压疮组织创面愈合的作用;阐明艾灸促进压疮组织血管新生的分子调控机制,为临床艾灸治疗压疮,乃至皮肤溃疡提供理论和实验依据。方法:采用自制压疮造模装置通过缺血-再灌注损伤方式建立2～3期压疮动物模型,将造模成功的70只SD雌性压疮缺血-再灌注损伤模型实验大鼠采用随机数字表法随机分为模型组和艾灸组,每组35只。每组根据干预时间的长短再分为1d、3d、5d、7d、10d五个亚组,每个亚组分别纳入7只实验大鼠。将35只正常健康大鼠不予造模处理,在模拟其他两组大鼠造模部位处给予碘伏处理,采用随机数字表法随机分为1d、3d、5d、7d、10d五个亚组,每个亚组纳入7只大鼠。模型组在模型制备成功后只给予碘伏常规处理,捆绑方式同其他两组。艾灸组在模型制备成功后,先给予碘伏常规处理,而后施以艾灸干预,采用直接艾灸压疮局部,以压疮创面为中心,1cm长度为半径,进行回旋灸操作,其中艾条燃烧端距压疮创面3cm左右。每日艾灸治疗1次,每次持续15min。通过非接触式电子温度仪及时调整艾条燃烧端与压疮创面的距离,使温度计的显示数值控制在(40℃～42℃)的适宜范围内,每0.5min测量一次创面的皮肤表面温度,温度仪探头距离创面中心3cm左右。自造模第5d开始对造模成功的实验大鼠进行干预方法的介入,分别于1d、3d、5d、7d、10d五个时间点取材前对压疮创面进行面积的测定以及创面局部平均血流灌注量的测定。采用HE染色法及透射电镜分别观察压疮创面组织的病理形态学变化及压疮皮肤组织的超微结构。利用激光共聚焦显微镜通过免疫荧光双标染色技术观察各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中CD31+PCNA+(即新生血管)的数量变化。通过免疫组织化学法检测各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF、RAS、P-ERK1/2蛋白的表达情况。利用实时荧光定量(Real-time PCR)技术从基因层面对各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA、RAS mRNA、RAF-1mRNA 以及 ERK mRNA 的表达水平进行检测。通过蛋白质印迹法(WesternBlot)从蛋白层面对各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF、VEGFR2及RAS蛋白表达水平、RAF-1与ERK1/2蛋白的磷酸化水平进行检测。结果:1.各组大鼠在不同时间点压疮创面愈合率比较发现,治疗1d后,各组组间进行压疮创面愈合率比较无明显差异(P>0.05),无统计学意义。与模型组比较,艾灸组在3d、5d、7d、10d四个时间点的创面愈合率均明显高于模型组,同一时间点进行两组组间比较,差异均显著(P<0.01),具有统计学意义。2.压疮损伤出现后,创面局部平均血流灌注量明显升高。经过艾灸干预后,艾灸组组内创面局部平均血流灌注量呈现先降低后升高的趋势,模型组组内趋势与艾灸组大致相同,两组均在7d时降至最低血流灌注量,但艾灸组在10d的创面局部平均血流灌注量已接近正常皮肤血流灌注量,而模型组创面局部平均血流灌注量恢复至正常皮肤血流灌注量所需时间明显超过10d。与空白组比较,模型组在1d～5d三个时间点碘伏处理前创面局部平均血流灌注量明显升高。模型组在7d～10d两个时间点碘伏处理前创面局部平均血流灌注量明显降低,同一时间点进行两组组间的比较,差异均显著(P<0.01)。与模型组比较,艾灸组在3d、5d两个时间点治疗前创面局部平均血流灌注量明显降低,同一时间点进行两组组间的比较,差异均显著(P<0.01)。艾灸组在1d、7d、10d三个时间点治疗前创面局部平均血流灌注量明显升高,模型组大鼠在1d～10d五个时间点碘伏处理前与碘伏处理后即刻创面局部平均血流灌注量比较,均无显著性差异。艾灸组大鼠在1d～10d五个时间点治疗前与治疗后即刻创面局部平均血流灌注量比较,治疗后即刻血流灌注量均显著提升,两者间均存在显著性差异。3.通过肉眼观察压疮创面的愈合过程可以发现,压疮大鼠创面中肉芽组织无论是在出现时间点方面,还是在其生长状态方面,艾灸组较模型组均具有明显的优势,艾灸组大鼠压疮创面一般在治疗3d后出现肉芽组织,而模型组在碘伏处理7d左右出现,艾灸组大鼠压疮创面中肉芽组织的生长状态也优于模型组,同时艾灸组大鼠压疮创面收缩速度更快,面积缩小更为明显。通过HE染色观察压疮创面组织病理形态学变化发现,与模型组比较,艾灸组的炎症细胞浸润高峰提前,成纤维细胞出现时间点更早,其增生程度及数量更为明显,肉芽组织出现时间提前,新生血管形成及表皮结构恢复的时间更早。4.通过透射电镜观察艾灸干预对大鼠压疮创面组织超微结构的影响,结果发现,与空白组比较,造模后表皮脱落或萎缩,原有正常皮肤结构发生改变。与模型组比较,艾灸组对于表皮结构的修复具有明显优势,在治疗5d后可见表皮结构,部分完整,部分仅可见基底层及棘层,在7d后可见表皮的完整全层结构。而模型组在碘伏处理10d后少部分表皮结构完整,大部分未见全层表皮结构,仅见基底层及棘层,未见颗粒层、透明层、角质层。艾灸组组内不同时间点,随着艾灸干预刺激的累积,5d～10d组中基底细胞及棘细胞的线粒体的结构、数量、形态由损伤后的肿胀、数量较少、不丰富、结构不清逐渐向修复后的不肿胀、数量较多、丰富、结构清晰的方向发展转变。模型组组内不同时间点,呈现了压疮创面损伤及经碘伏处理后自身修复中的基本病理状态变化,直至碘伏处理10d后,基底细胞及棘细胞的线粒体仍呈肿胀、数量较少、不丰富、大而空的形态特点。在炎性细胞的镜下改变方面发现,艾灸组从1d的大量中性粒细胞浸润,3d中等量的中性粒细胞,5d的不新鲜、陈旧性中性粒细胞,7d吞噬细胞及淋巴细胞,10d的淋巴细胞。模型组在碘伏处理5d后为急性炎症的高度浸润阶段,模型组的炎症细胞浸润期延长。与模型组比较,艾灸组从整体上提前急性炎症浸润的高峰,从整体进程上缩短压疮创面修复时间。5.免疫荧光双标染色结果显示,1d～10d后,与空白组相比,模型组创面组织中CD31+PCNA+(新生血管)数量明显增多,两者组间比较差异均显著(P<0.01),具有统计学意义。1d～7d后,艾灸组压疮创面组织中的CD31+PCNA+(新生血管)数量均高于模型组,但其增高的程度各有不同,由1d的显著→3～5d的极显著→7d的不显著,10d后,模型组的压疮创面组织中CD31+PCNA+(新生血管)数量高于艾灸组,但其增高程度不明显,差异不显著。艾灸组与模型组两组组内CD31+PCNA+(新生血管)均呈先升高,而后降低的趋势,但两组组内高峰出现的时间不同,前者的组内CD31+PCNA+(新生血管)数量高峰出现于治疗5d后,而后者则为碘伏处理7d后。6.免疫组化结果显示,VEGF蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中,在上皮细胞、巨噬细胞中均有表达。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平显著升高,两组组间比较差异均显著,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。RAS蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS蛋白表达水平明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS蛋白表达水平显著升高,两组组间比较差异均显著。艾灸组与模型组两组组内RAS蛋白均呈现逐渐升高的趋势。P-ERK1/2蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中。3d～10d后,与空白组比较,模型组压疮创面组织中P-ERK1/2蛋白表达水平明显升高,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中P-ERK1/2蛋白表达水平均出现不同程度地升高,于3d～5d呈显著增高,7d～10d呈略微升高。艾灸组与模型组两组组内P-ERK1/2蛋白表达均呈现先升高后降低的表达趋势,但两组组内表达高峰值存在区别,艾灸组组内高峰值出现在治疗3d后,而模型组组内高峰值出现在碘伏处理5d后。7.通过Real-time PCR实验结果显示,1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平显著升高,两组组间比较差异均显著,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。VEGFR2 mRNA结果与VEGF mRNA整体上相似,体现了 VEGF发挥生物学效应的前提是与其受体结合,VEGF与受体VEGFR2发生特异性结合,从而促进血管内皮细胞的增殖、分裂以及新生血管的形成。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS mRNA表达水平明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS mRNA表达水平显著升高,分别进行两组组间比较,差异均显著。艾灸组与模型组组内RAS mRNA表达均呈现逐渐升高的趋势。当压疮损伤出现后,创面组织中RAF-1mRNA、ERKmRNA表达水平均未见明显变化,经过艾灸干预后,各组组间均未见明显变化。8.通过WesternBlot结果显示,1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平显著升高,两组组间比较差异均显著,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。VEGFR2蛋白结果与VEGF蛋白整体上相似,体现了 VEGF发挥生物学效应的前提是与其受体结合,VEGF与受体VEGFR2发生特异性结合,从而促进血管内皮细胞的增殖、分裂以及新生血管的形成。1d～10d,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平均明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平显著升高,两组组间比较差异均显著。模型组组内RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平均呈现逐渐升高的趋势,艾灸组组内RAS蛋白亦呈逐渐升高趋势,磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平则为1d-7d升高,7d～10d降低。3d～10d后,与空白组比较,模型组压疮创面组织中磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平明显升高,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平均出现不同程度地升高,于3d～5d呈显著增高,7d～10d呈略微升高。艾灸组与模型组两组组内磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平均呈现先升高后降低的表达趋势,但两组组内表达高峰值存在区别,艾灸组组内高峰值出现在治疗3d后,而模型组组内高峰值出现在碘伏处理5d后。结论:1.艾灸能够有效促进压疮创面的愈合。2.艾灸对压疮组织创面局部平均血流灌注量具有双向良性调整作用。艾灸干预即刻后能够显著增加压疮组织创面局部平均血流灌注量。3.艾灸干预能够有效促进血管内皮细胞的增殖,增加新生血管的数量,促进压疮组织的血管新生。4.艾灸干预分别从蛋白、基因层面上调压疮创面组织中VEGF及其受体VEGFR2的表达水平。5.RAS/RAF/ERK信号通路参与压疮的修复过程,艾灸干预通过激活RAS/RAF/ERK信号通路,上调RAS蛋白及其mRNA的表达水平、促进RAF-1蛋白与ERK1/2蛋白的磷酸化水平,增强RAS/RAF/ERK信号通路的活性,发挥促进血管内皮细胞增殖的作用。6.RAS/RAF/ERK信号通路是艾灸干预作用的重要靶点,可能是艾灸促进压疮组织血管新生的作用机制之一。