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对虾因其鲜美可口且富含各种营养成分而深受全球消费者喜爱,但近年来关于对虾所引发的食物过敏案例不容忽视,引起了政府的高度重视,成为了食品安全的热点问题之一。本文以中国对虾中主要过敏原原肌球蛋白为实验对象,利用人源性肥大细胞和Balb/c小鼠模型全面评价酶交联技术对中国对虾中原肌球蛋白致敏性的影响,并探究酶交联技术对原肌球蛋白结构的影响。主要内容如下:1、从中国对虾中提取纯化原肌球蛋白(tropomyosin,TM),经转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TG)/酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)催化反应形成交联产物,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)观察不同的酶量以及反应时间下原肌球蛋白的交联情况;利用20位过敏患者血清验证不同酶量以及反应时间作用下原肌球蛋白与IgE的结合能力,结果表明转谷氨酰胺酶最适催化条件为在1 U/mg的酶量下于37℃反应24 h,酪氨酸酶最适催化条件是在800 U/mL的酶量下于37℃反应24 h。通过扫描电镜直接观察交联蛋白,研究表明交联后蛋白呈现出紧密交织的状态。利用体外模拟消化实验,本研究发现TM不耐胃蛋白酶消化,反应60 min后基本完全降解,而交联产物耐胃蛋白酶消化作用。为进一步验证酶交联后蛋白的致敏性,进行了人源性肥大细胞脱颗粒实验。通过设立不同的抗原浓度刺激肥大细胞脱颗粒实验,得出最适抗原刺激浓度为10μg/mL。酶交联后的蛋白以10μg/mL的浓度刺激肥大细胞,结果显示酶交联处理组组胺、β-氨基己糖苷酶以及IL-8、TNF-α的释放量下降,证明酶交联技术对蛋白的致敏性有一定的消减作用。2、利用圆二色光谱分析原肌球蛋白交联后蛋白二级结构的变化。0 h时α-螺旋含量为49.7%,β-转角24.7%,无规则卷曲25.6%,随着酶交联反应时间的延长,α-螺旋含量下降,无规则卷曲以及β-转角含量增加,表明蛋白二级结构改变。同样对红外光谱图进行去卷积、二阶导数处理后得到蛋白酰基Ⅰ带谱图,通过计算得到各二级结构百分含量的值。结果显示随着酶处理时间的延长,当反应24 h时,α-螺旋含量最低,β-折叠含量升至最高,二级结构由α-螺旋向β-折叠转变。在荧光光谱分析中,酶交联后蛋白表面疏水性普遍比0 h时强,反应24 h时蛋白表面疏水性最强,说明酶交联同时改变了蛋白三级结构。在紫外光谱分析中,酶交联后蛋白在280 nm处的最大紫外吸光度值增强且发生蓝移,说明蛋白溶液极性和结构改变。本研究进一步利用皮尔逊二元相关性统计方法分析转谷氨酰胺酶催化交联后蛋白结构变化与致敏性消减率之间的关系,结果显示蛋白致敏性的消减率与蛋白二级结构相关性最显著。3、利用小鼠体内实验全面评价酶交联后蛋白的致敏性变化。结果显示,TM处理组小鼠体重增长滞后,且过敏症状最明显,酶交联处理组症状较为缓和。酶交联处理组小鼠血清中的组胺和IgE含量显著低于TM组;同时,酶交联处理组细胞因子IL-10和IL-4产量也显著低于TM组,说明酶交联后的蛋白刺激小鼠脾脏细胞释放炎性因子能力降低;另外,树突状细胞(dendritic cells,DC)细胞数量TM组明显高于其他组,酶交联组的调节性T细胞(regulatory cells,Tregs)数量显著高于TM组,表明酶交联蛋白可能通过诱导免疫耐受抑制食物过敏反应。综上所述,酶交联技术能有效地减弱蛋白对小鼠的致敏效果。