目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是长期大量饮酒所致的肝脏损害性病变,其病理改变包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。关于ALD的发病机理目前尚不清楚,近年来有人提出以氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说,“第一次打击”使脂类沉积在肝细胞,导致脂肪肝,“第二次打击”涉及内毒素、细胞因子参与的氧化应激和脂质过氧化。氧化应激和内毒素是ALD发病过程中不可分割的两个中心环节,二者均可激活Kupffer细胞,活化的Kupffer细胞通过产生氧自由基和分泌细胞因子招募中性粒细胞、淋巴细胞浸润引起肝内炎症反应参与ALD的发病。解偶联蛋白(uncoupling proteins, UCPs)是线粒体内膜上可以调节质子跨膜转运的载体蛋白,具有解偶联活性。目前共发现5种亚型,分别为UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5,其中UCP2虽无组织特异性,但在正常肝组织中仅在Kupffer细胞表达,肝细胞无表达或表达水平很低,当肝组织受损时,肝细胞则大量表达UCP2。UCP2可以通过调节质子跨膜转运参与能量消耗和脂质代谢,可能参与ALD的氧化应激与脂质过氧化。本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫组织化学染色及逆转录聚合酶链反应( reverse transcription- polymerase chain reaction, RT-PCR)的方法观察UCP2蛋白及UCP2 mRNA的表达情况,探讨UCP2在ALD发病过程的表达及意义,为有效防治ALD提供新的思路。方法:选用雄性健康清洁级Wister大鼠50只,体重200±20g,正常饲养1周后随机分出10只为正常对照组,其余动物采用逐渐增加酒精浓度(浓度30%-60%,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法酒精灌胃,分别于4周、8周、12周和16周末随机处死动物8只、8只、8只和9只,留取血清及肝组织标本并制备10%的肝匀浆,应用日本OLYMPUS AU-600全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT),天冬氨酸氨基转移酶( aspartate aminotransferase, AST )和乙酰胆碱酯酶(cholinesterase, CHE);应用比色法检测肝匀浆肝组织蛋白含量,以g(mg)为单位分别测定肝匀浆甘油三酯(triglyceride, TG )、氧自由基( oxygen free radical, OFR )、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的含量;应用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测血清白细胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α);取部分肝组织立即冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,观察肝细胞脂变性情况;另取肝组织固定于4%中性福尔马林溶液,石蜡包埋,5μm切片行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肝组织的普通病理改变,天狼红染色观察肝组织纤维化程度,DPAS染色观察肝组织Kupffer细胞的变化;并用石蜡切片进行UCP2免疫组织化学染色,观察肝组织UCP2蛋白表达情况;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用RT-PCR观察大鼠肝组织UCP2 mRNA的表达。结果:1血清生化指标的变化:随着造模时间的延长,血清ALT和AST水平逐渐升高,CHE逐渐降低,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。2血清细胞因子水平的变化:随着造模时间的延长,血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量逐渐升高,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。3肝组织匀浆氧化应激指标的变化:随着造模时间的延长,肝组织匀浆TG、OFR及MDA含量逐渐升高,SOD含量逐渐降低,与正常对照组比较P<0.05或P<0.01。4肝组织病理学改变:4周大鼠肝细胞出现小叶中央静脉周围肝细胞脂肪变性,随着造模时间的延长,肝细胞脂肪变性逐渐加重,肝小叶内坏死灶明显增多和纤维组织增生,16周大鼠肝细胞呈现弥漫小泡性脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成。冰冻切片苏丹Ⅳ染色显示正常对照组大鼠肝组织无脂肪变性,模型4周组大鼠肝细胞胞浆中出现少量红色脂滴,随着造模时间延长,红色脂滴逐渐增多,至16周表现为大量红色脂滴分布于肝细胞内。天狼红染色显示模型4周组大鼠肝组织无明显纤维组织增生,模型12周组大鼠肝组织出现明显窦周纤维化和纤维化间隔形成趋势,模型16周组大鼠肝组织出现明显纤维间隔。5 Kupffer细胞的变化:肝组织DPAS染色显示正常对照组肝组织汇管区存在少量DPAS阳性细胞,模型4周组大鼠肝小叶Ⅰ带DPAS阳性细胞增多,随着造模时间的延长阳性表达明显增强,模型16周组大鼠整个肝小叶内窦周散在分布DPAS阳性细胞,胞浆丰富,体积肥大。6免疫组化法检测大鼠肝组织UCP2蛋白的表达:光镜下,正常组大鼠肝脏内仅表达少量UCP2蛋白,随着造模时间的延长阳性表达逐渐增强,主要表达于肝细胞胞浆内。7 RT-PCR法检测UCP2 mRNA的表达量:正常组大鼠肝组织中仅表达少量UCP2 mRNA,随着造模时间的延长,其表达量逐渐增加,与正常对照组比较P<0.05。8肝组织中UCP2的相对表达量与血清ALT、AST水平呈正相关,相关系数分别为0.38和0.63,P值分别为P<0.05和P<0.01,与CHE呈负相关,相关系数为-0.43,P<0.01。9肝组织中UCP2的相对表达量与血清细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈正相关,相关系数分别为0.85,0.75和0.70,P值均<0.01。10肝组织中UCP2的相对表达量与肝匀浆中氧化指标TG、OFR和MDA的含量呈正相关,相关系数分别为0.75、0.74和0.73,P值均<0.01,与抗氧化指标SOD呈负相关,相关系数为-0.55,P<0.01。结论:1应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠ALD模型,该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床ALD的基本病变。2 ALD发病过程中存在氧化应激,氧化应激参与ALD的发病过程。3 ALD发病过程中存在Kupffer细胞的活化与增生,活化的Kupffer细胞参与炎症反应和氧化应激,在ALD发病过程中的发挥重要作用。4 ALD发病过程中UCP2表达逐渐增强,高表达的UCP2与血清促炎性细胞因子变化呈正相关,是影响ALD肝脏炎症损伤的重要因素之一;高表达的UCP2还与肝脏氧化应激指标呈正相关,参与ALD中的氧化应激和脂质过氧化反应。