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【目的】间充质干细胞在骨重建过程中处于重要调控地位,对组织修复及细胞生长具有重要作用。间充质干细胞是一类多能成体干细胞,能够在细胞内外信号的诱导下分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等不同类型的成体细胞,调控骨重建及细胞生长。经典Wnt通路是间充质干细胞的成骨分化的关键因素,该通路还能够与包括维甲酸在内的多种核受体通路相互作用,进一步调控间充质干细胞的分化。本研究主要观察全反式维甲酸(All-trans-retinoic acid,ATRA)对Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化的促进作用并对其中的机制进行探讨。【方法】1、ATRA对Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化的作用。对C3H10T1/2细胞进行处理后进行碱性磷酸酶的测定及染色,观察其对早期成骨标志物碱性磷酸酶表达的作用;同时通过免疫细胞化学染色观察其对晚期成骨标志物骨钙蛋白和骨桥蛋白表达的影响。茜素红染色用于观察在该刺激因素下间充质干细胞形成矿化结节的能力及数量。2、通过体外培养和干细胞皮下移植实验观察ATRA对Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化的作用。取E18.5天小鼠的后肢进行体外培养,观察其对软骨内成骨的影响。使用腺病毒感染的C3H10T1/2细胞进行皮下注射,通过对生成物进行计算机断层扫描及重建分析、H&E染色、Masson’s染色观察在以上处理过程中间充质干细胞在体内的成骨分化情况。3、ATRA对Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化机制的研究。使用维甲酸和(或)Wnt3A处理C3H10T1/2细胞,通过萤光素酶报告基因检测和Western blotting方法观察β-catenin/Tcf/Lef对下游启动子的调控作用,以及β-catenin在胞核内的累积情况;通过qPCR和Western blotting方法检测维甲酸代谢通路中关键酶Cyp26a1的表达情况的变化。4、PI3K/AKT/GSK3β通路对ATRA与Wnt3A联合诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。采用Western blotting方法检测ATRA和(或)Wnt3A对间充质干细胞(C3H10T1/2细胞和MEFs细胞)AKT、GSK3β蛋白表达和磷酸化修饰的影响。随后使用PI3K的抑制剂LY294002观察以上处理因素对PI3K/AKT/GSK3β通路上关键蛋白表达及磷酸化的变化,进行碱性磷酸酶的检测用于观察其对成骨分化的抑制作用。同时观察在以上处理条件下对β-catenin ser552位点的磷酸化修饰的影响。【结果】1、ATRA促进Wnt3A诱导的间充质干细胞成骨分化。不同浓度的ATRA对Wnt3A诱导的间充质干细胞碱性磷酸酶表达具有促进作用,其中以20μM浓度最为显著。同时,ATRA还能显著促进晚期成骨标志物骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达,促进矿化结节的形成。2、在骨组织体外培养实验中,Wnt3A+ATRA组胫骨横截面荧光面积显著大于对照组及单独Wnt3A和ATRA组;H&E染色结果显示Wnt3A+ATRA组中肥大的软骨区域也大于另外三组。在裸鼠体内细胞移植实验中,对照组和仅感染Wnt3A组无异位骨生成,Wnt3A+RARα组和RARα组可见异位骨生成,且共同诱导组形成的异位骨体积和骨密度较ATRA组显著增加。3、在对机制的研究中,通过萤光素酶报告基因检测我们发现ATRA+Wnt3A组能够诱导β-catenin/Tcf/Lef与启动子结合,促进成骨相关基因的转录;利用C3H10T1/2细胞和MEFs细胞分别进行Western blotting和免疫荧光检测,发现ATRA+Wnt3A组核内β-catenin的蛋白含量明显高于其它组;进一步研究显示,Wnt3A能够促进维甲酸代谢关键酶Cyp26a1的降解,相反,沉默β-catenin则会促进Cyp26a1表达。4、进一步研究显示ATRA和Wnt3A通过PI3K/AKT/GSK3β通路促进间充质干细胞成骨分化。ATRA+Wnt3A显著促进AKT和GSK3β的磷酸化修饰,增强AKT蛋白激酶的活性,促进GSK3β的降解,PI3K抑制剂LY294002能够拮抗以上促进作用,同时也能抑制碱性磷酸酶的表达;另外,AKT的磷酸化修饰能够促进β-catenin ser552位点磷酸化,该位点的磷酸化能够促进β-catenin从细胞连接处转移到细胞质和细胞核,进行细胞信号的传导。【结论】1、Wnt3A和ATRA在促进间充质干细胞分化成骨方面具有协同效应;2、ATRA促进Wnt3A诱导的β-catenin/Tcf/Lef对下游基因的激活和β-catenin的核转位;3、Wnt3A促进Cyp26a1的降解,延长ATRA的作用;4、Wnt3A和ATRA通过PI3K/AKT/GSK3β通路促进间充质干细胞成骨分化。