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D-苯丙氨酸是L-苯丙氨酸的手性对映体，与L-苯丙氨酸理化性质近似，仅旋光性相反，在医药、食品等领域具有广泛的应用价值，D-苯丙氨酸属于非蛋白型氨基酸，很难从天然产物中大量获得。其目前的主要生产方法为化学合成法，成本很高，无法满足D-苯丙氨酸逐渐升高的市场需求。因此，发展新的廉价的生产D-苯丙氨酸乃至D-氨基酸方法是目前国际上氨基酸领域的研究热点。直接发酵法是L-苯丙氨酸的主要生产方法，其效率高、低成本、工艺流程简单。但目前国内外仍无法实现D-苯丙氨酸的直接发酵法生产，其最主要原因就是没有性能良好的的D-苯丙氨酸生产菌株。
本文以野生型大肠杆菌W3110为出发菌株，以构建D-苯丙氨酸基因工程菌株为目标，对大肠杆菌L-苯丙氨酸合成与分解代谢进行系统的研究和改造，并且构建了其本身不存在的D-苯丙氨酸合成模块。通过无痕敲除等基因工程手段，初步构建了D-苯丙氨酸基因工程菌株。
首先对大肠杆菌中存在的苯丙氨酸合成途径进行改造，通过敲除邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)、分支酸变位酶基因(tyrA)，阻断合成色氨酸、酪氨酸的合成支路；解除关键酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因(pheA)的反馈抑制，构建pheAfor基因和另一限速酶DAHP合酶基因aroF的表达质粒，获得了基因工程菌株EC237。我们通过摇瓶发酵验证EC237具有积累L-苯丙氨酸的能力，同时也表明上述基因工程改造可以有效的扩大L-苯丙氨酸的合成通路的代谢流；在EC237的基础上，引入了来源于枯草芽胞杆菌W168的D-氨基转移酶，构建了D-苯丙氨酸生物合成途径，通过敲除L-苯丙氨酸转氨酶基因(aspC,tyrB)使苯丙酮酸得到有效积累，通过敲除D-苯丙氨酸分解酶的基因(dadA)阻断D-苯丙氨酸的分解，最终构建了D-苯丙氨酸的初级基因工程菌EC238。经过48h的摇瓶发酵菌株EC238有2.35mmol/L的苯丙氨酸积累；在7.5L发酵罐上发酵48h，菌株有6mmol/L的苯丙氨酸积累，菌株的产酸能力与摇瓶发酵相比提高2.55倍，其中有0.5mmol/L的D-苯丙氨酸。通过发酵实验我们证明了菌株EC238有可能具有合成D-苯丙氨酸的能力。
D-苯丙氨酸初级基因工程菌株的构建为高产菌株的构建奠定了基础，本课题的研究也将为利用葡萄糖发酵生产其他D-氨基酸及衍生物的工业微生物遗传育种提供理论基础和实践经验。