帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中老年常见的神经系统变性疾病,临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍等。最近几年PD的非运动症状逐渐引起人们的注意。目前公认PD的发病机制为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewy body)形成,同时兴奋性毒性作用、线粒体功能障碍等诸多因素参与了 PD的发病。根据PD的发病机制,延缓黑质多巴胺能神经元的变性和补充多巴胺是治疗的基本原则,目前,左旋多巴仍然是治疗帕金森病的“金标准”,在疾病初期具有明显的缓解作用,但长期服用容易出现直立性低血压、心律失常,严重时出现异动症、剂末恶化现象、“开-关”现象等并发症。神经干细胞移植和基因治疗是近几年新兴的治疗手段,但是因为成本和风险较高,尚不能用于临床的推广。在PD的众多病理机制中,兴奋性氨基酸的毒性作用一直是国内外研究的热点,谷氨酸转运体通过摄取突触间隙的谷氨酸,防止兴奋性毒性作用的产生。谷氨酸(glutamate,Glu)是哺乳动物中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质,释放到突触间隙发挥作用后很快被位于星形胶质细胞和神经元胞膜上的兴奋性谷氨酸转运体所摄取。真核生物兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporters,EAATs)分为 GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型。谷氨酸转运体利用Na+-K+-ATP酶形成的Na+和K+的电化学浓度梯度来完成谷氨酸的转运,谷氨酸转运体每转运一个谷氨酸分子,伴有3个Na+和1个H+同向转运入细胞内,1个K+反向转运至细胞外。2004年Gouaux实验室成功解析了谷氨酸转运体的同族体,原核生物Pyrococcus horikoshii天冬氨酸转运体GltPh的晶体结构。研究表明它是一个由三个单体组成的碗状三聚体,其中的每个单体都有一个底物转运通道,是一个独立的功能单位,由八个跨膜区段(transmembrane domain,TM)TM1~TM8以及两个方向相反的发夹结构(helical hairpin,HP)HP1、HP2组成。GltPh不同转运时相的晶体结构研究表明HP1、HP2及TM7、TM8组成底物结合区,在转运底物的不同时相伴随有各个区段的相互运动。之前已有报道HP1作为转运体向胞内开放的闸门以及底物结合区的一部分,在底物的转运中发挥重要作用,而TM2作为三聚体的界面,在转运循环中位置未发生改变。但是HP1与TM2在EAAT1转运底物过程中的相互运动是怎样的,目前尚未见报道。研究表明,通过上调EAATs的表达,可以减弱兴奋性毒性对神经系统的损伤。例如头孢曲松钠可以通过激活核转录因子(nuclear factor-kB,NF-kB)提高GLT-1的表达,降低突触间隙的谷氨酸浓度。应用头孢曲松钠治疗PD小鼠,发现头孢曲松钠能够在提高GLT-1表达的同时,降低PD小鼠黑质和纹状体区多巴胺神经元的死亡,并且头孢曲松钠可以减弱PD小鼠的运动行为障碍以及改善认知能力。但是头孢曲松钠在PD中发挥抗凋亡效应的具体机制,目前尚未阐明。因此,本课题主要研究谷氨酸转运体的转运机制及其在PD发病中表达异常的机制及调控策略,探讨通过提高谷氨酸转运体的表达及功能来治疗PD的可能性。全部工作分为四个部分简述如下。一、在转运底物过程中谷氨酸转运体EAAT1 HP1与TM2之间的相互运动如前所述,目前关于谷氨酸转运体EAAT1在转运底物过程中HP1与TM2之间的相互运动关系尚未见报道。在本研究中,我们将EAAT1上的内源性半胱氨酸突变成其它氨基酸,得到cysteine less EAAT1(CL-EAAT1)。其后我们将位于TM2和HP1上的V96和S366位点分别突变成半胱氨酸。在加入氧化剂CuPh和Cd2+后,我们发现其对于V96C/S366C突变体转运活性具有抑制效应。加入底物谷氨酸和钾离子后可以显著地减弱CuPh的抑制效应(P<0.01),而抑制剂底物结构类似物TBOA则可以显著地增强CuPh的抑制效应(P<0.01)。我们也检测了处于不同转运时相时CuPh对突变体动力学参数影响的变化,CuPh对于不同底物或者抑制剂状态下的Km并未产生显著影响(F值:0.125;P值:0.998),但是CuPh却显著降低了不同底物或者抑制剂状态下的Vmax(F值:21.317;P值:<0.001)。我们分析位于TM2和HP1上的V96和S366位点在转运循环不同时相中其相对位置的改变:位于TM2上的V96位点和HP1上的S366位点在转运体向胞内开放时是远离的,而在转运体向胞外开放时是相互靠近的。在EAAT1转运底物过程中,转运体向胞内开放时HP1向下运动,从而导致其与TM2之间的距离变远。本部分工作揭示了在转运循环中担负重要角色的HP1和组成三聚体界面的TM2在谷氨酸转运体EAAT1转运底物过程中的相互运动,为阐明EAAT1的转运机制奠定了一定的基础。EAATs转运机制的解析对研究帕金森病中EAATs表达功能变化及其调节机制具有重要指导意义。二、头孢曲松钠通过抑制NF-KB/JNK/c-Jun通路在MPP+染毒星形胶质细胞上发挥神经保护效应如前所述,谷氨酸转运体能够迅速摄取突触前神经元释放的谷氨酸,有效防止谷氨酸兴奋性毒性效应的产生。2005年抗生素头孢曲松钠首次被证实通过提高谷氨酸转运体GLT-1的表达而发挥神经保护效应。然而头孢曲松钠是否能够通过调控谷氨酸转运体的表达和功能从而在帕金森病中发挥保护效应以及所涉及的调控机制尚不清楚。我们应用神经毒素MPP+染毒星形胶质细胞制备了PD细胞模型,并通过谷氨酸转运体转运活性和细胞活力实验进行了证实,结果均显示随着MPP+浓度的增加,谷氨酸转运体的转运活性(F值:11.107;P值:0.001)和星形胶质细胞的活力逐渐降低(F值:37.372;P值:<0.001和F值:39.283;P值:<0.001)。我们检测了不同浓度头孢曲松钠的保护效应,发现100μM的头孢曲松钠能够显著提高MPP+染毒星形胶质细胞谷氨酸转运体转运活性(P<0.05),头孢曲松钠可以提高MPP+染毒星形胶质细胞的活力,但是并未显示统计学差异(P>0.05)。应用免疫荧光和免疫印迹杂交我们分析了头孢曲松钠对于染毒星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1在细胞膜和总蛋白水平表达的影响,发现头孢曲松钠能够提高正常星形胶质细胞GLT-1总蛋白水平的表达,但是对于细胞膜上GLT-1的表达没有显著的影响,而头孢曲松钠能够显著提高MPP+染毒星形胶质细胞胞膜上GLT-1的表达水平(P<0.05)。我们研究了头孢曲松钠对NF-kB信号通路的影响,结果显示头孢曲松钠和MPP+单独应用均能提高NF-kB的表达,而头孢曲松钠和MPP+共同处理则降低了NF-kB的表达。应用NF-kB抑制剂BAY 11-7082后,染毒星形胶质细胞的谷氨酸转运体转运活性和GLT-1蛋白表达水平均有所升高,而头孢曲松钠单独处理组的谷氨酸转运功能和GLT-1蛋白表达并未见明显差异,一方面提示头孢曲松钠通过抑制NF-kB在MPP+染毒星形胶质细胞上的促凋亡作用进而发挥神经保护效应,另一方面也提示了头孢曲松钠提高正常星形胶质细胞上GLT-1的表达并不是通过NF-kB信号通路。我们进一步研究了 JNK/c-Jun通路,我们发现头孢曲松钠能够抑制MPP+染毒星形胶质细胞JNK/c-Jun通路的激活,同时,在应用NF-kB抑制剂BAY 11-7082后,MPP+染毒星形胶质细胞JNK/c-Jun通路也得到抑制,从而说明NF-kB是JNK/c-Jun的上游调控通路。BAY 11-7082或者SP600125提高了 MPP+染毒星形胶质细胞谷氨酸转运体的转运活性、细胞膜表面GLT-1的表达以及MPP+染毒星形胶质细胞的活力。总结以上结果我们得出头孢曲松钠通过抑制NF-KB/JNK/c-Jun通路减轻星形胶质细胞的凋亡进而发挥神经保护效应。本部分工作揭示了头孢曲松钠调控GLT-1表达的具体机制,同时也为临床应用头孢曲松钠治疗PD提供了理论基础。三、泛素连接酶E3 Nedd4-2对MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠谷氨酸转运体表达的调节通过第二部分的研究,我们发现星形胶质细胞膜蛋白水平EAATs的表达对其正常转运活性具有重要作用,而EAATs的表达在细胞膜和胞浆之间处于动态平衡。泛素化修饰对EAATs在细胞膜和胞浆之间周转循环的调控具有重要作用,因此在这一部分我们主要研究泛素连接酶E3对EAATs的调控。目前的研究已经证实泛素连接酶E3与帕金森病的发病密切相关,并且神经前体细胞表达的发育下调基因 4-2(Neuronal precursor cell Expressed Developmentally Down-regulated 4-2,Nedd4-2)可与EAATs形成复合物并对其表达起调节作用。然而在帕金森病中Nedd4-2是否会介导EAATs的泛素化以及通过将Nedd4-2的表达下调是否会提高谷氨酸转运体的表达进而发挥保护效应,目前还未见相关报道。我们制备了 PD小鼠模型,然后我们选取三个不同时间点(注射MPTP第3天,造模成功后的第1天和第3天)进行大脑不同部位(中脑、纹状体、大脑皮层)的取材,检测了谷氨酸转运体GLT-1、GLAST、磷酸化Nedd4-2以及Nedd4-2的表达。通过Western blotting,我们发现在造模成功后第3天的中脑和纹状体PD组比对照组的GLT-1表达显著降低,(中脑:t值:5.336;P值:0.013)和(纹状体:t值:4.087;P值:0.015)。而在造模成功后第3天的纹状体PD组比对照组GLAST的表达显著降低(t值:4.254;P值:0.041)。纹状体和大脑皮层在造模成功后第3天PD组比对照组GLT-1、GLAST mRNA表达水平也出现了显著的降低,(纹状体GLT-1:t值:4.242;P值:0.013),(纹状体GLAST:t 值:4.165;P 值:0.014),(大脑皮层 GLT-1:t 值:4.434;P 值:0.047)和(大脑皮层GLAST:t值:4.065;P值:0.021)。值得注意的是,中脑部位在造模成功后第3天PD组比对照组GLT-1 mRNA表达水平出现了显著的升高(P<0.05),我们推测GLT-1的表达可能存在一些转录后水平的调控。我们进一步应用免疫共沉淀和免疫荧光来检测MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠模型上Nedd4-2与EAATs的相互作用以及EAATs的泛素化水平。通过应用Nedd4-2或GLT-1为捕获抗体,我们发现了在MPP+染毒星形胶质细胞上Nedd4-2与GLT-1的相互作用,而GLAST与Nedd4-2的相互作用在MPP+组和对照组没有明显差异。以GLT-1或者泛素Ub为捕获抗体,我们发现了在MPP+染毒星形胶质细胞上伴随有GLT-1的泛素化,但是GLAST并未发生泛素化。在PD小鼠模型上,我们发现了中脑部位Nedd4-2与GLT-1以及GLAST的相互作用,而以Ub为捕获抗体,我们发现了中脑GLT-1和GLAST泛素化水平的增加,而尤以GLAST的泛素化更为显著(P<0.05)。在纹状体部位,Nedd4-2与GLT-1仅在正常情况下发生相互作用,而GLAST与Nedd4-2的相互作用在PD组和对照组没有显著差异。同时GLT-1和GLAST在三聚体部位的泛素化水平在PD组较为显著(P<0.05)。这些结果证实在MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠模型上Nedd4-2与EAATs的相互作用以及EAATs的泛素化。将Nedd4-2的表达下调是否会提高GLT-1的表达而发挥神经保护效应?在这部分工作中,我们设计并合成了针对Nedd4-2的siRNA,在进行了转染效率和干扰效率的检测后,我们应用siNedd4-2和MPP+处理星形胶质细胞,我们发现应用siNedd4-2可以提高MPP+染毒星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1在细胞膜和总蛋白水平的表达,以及星形胶质细胞的谷氨酸摄取活性(P<0.05)。本部分工作揭示了在MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠模型上Nedd4-2与EAATs的相互作用以及EAATs的泛素化。通过将Nedd4-2进行RNA干扰可以提高MPP+染毒星形胶质细胞上谷氨酸转运体GLT-1的表达和对谷氨酸的摄取活性,提示我们Nedd4-2有可能会通过将GLT-1进行泛素化从而介导兴奋性毒性效应,而Nedd4-2可能会成为治疗PD的一个新靶标。四、雷帕霉素对PD的神经保护效应及机制研究通过第二部分和第三部分的研究,我们发现在MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠上伴随有EAATs表达和功能的降低,通过提高EAATs的表达能够发挥一定的神经保护效应。有文献报道之前应用于免疫抑制治疗的雷帕霉素可以通过mTOR/Akt/NF-KB通路促进EAATs的表达,但是雷帕霉素在PD中对EAATs表达和功能的影响尚不清楚。并且雷帕霉素可以通过mTOR通路发挥多种神经保护效应,因此在这一部分我们研究了雷帕霉素对MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠模型上EAATs表达和活性的影响,并且我们也研究了雷帕霉素对MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠血清以及脑内白细胞介素-6(interlukin-6,IL-6)表达的影响。根据正文实验方法所述,我们应用雷帕霉素治疗PD小鼠,通过动物行为学试验,我们发现雷帕霉素能够显著改善PD小鼠的运动行为障碍(悬挂试验:P<0.01;爬杆试验:P<0.05)。雷帕霉素能够显著提高中脑和纹状体酪氨酸羟化酶的表达(P<0.05),降低多巴胺神经元的凋亡(P<0.01)以及α-突触核蛋白的表达水平(P<0.01),表明雷帕霉素对PD小鼠具有显著的神经保护效应。通过进一步的研究,我们发现雷帕霉素能够提高MPP+染毒星形胶质细胞上IL-6、p-JAK2、p-STAT3以及GLT-1的表达和活性。雷帕霉素治疗后,显著提高了 PD小鼠血清和中脑IL-6的表达水平以及GLT-1在中脑的表达水平(血清IL-6表达:P<0.01,中脑IL-6表达:P<0.05;中脑GLT-1表达.P<0.01)。雷帕霉素也显著降低了 PD小鼠血清中IFN-y的表达水平(P<0.01)。我们推测一方面,雷帕霉素会通过提高谷氨酸转运体的表达和活性,降低谷氨酸兴奋性毒性效应对多巴胺神经元的损伤,另一方面,雷帕霉素可能会通过提高IL-6的表达进而激活下游的JAK2/STAT3信号通路,发挥神经保护效应,此外雷帕霉素也可能会通过抑制炎症反应进而发挥保护效应。本部分工作发现了雷帕霉素对PD小鼠的神经保护效应,我们的结果表明雷帕霉素提高了 MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠中脑谷氨酸转运体GLT-1表达。同时雷帕霉素显著提高了 MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠血清以及中脑IL-6的表达,雷帕霉素也显著降低了 PD小鼠血清中IFN-γ的表达水平。我们的研究为深入揭示雷帕霉素在PD中的神经保护效应及机制提供了理论和实验依据。综上,本研究通过结构和功能学实验揭示了在转运循环中担负重要角色的HP1和组成三聚体界面的TM2在谷氨酸转运体EAAT1转运循环不同时相的相互运动。通过头孢曲松钠处理MPP+染毒星形胶质细胞,报道头孢曲松钠可以通过抑制NF-kB/JNK/c-Jun通路来发挥抗凋亡机制的,这种抗凋亡效应主要体现在头孢曲松钠提高了星形胶质细胞的活力和细胞膜上GLT-1的表达,并且提高了星形胶质细胞谷氨酸转运体的转运活性。我们在MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠模型上发现了 Nedd4-2和EAATs的相互作用以及EAATs的泛素化,通过将Nedd4-2进行RNA干扰可以提高MPP+染毒星形胶质细胞上谷氨酸转运体GLT-1的表达和对谷氨酸的摄取活性。我们发现了雷帕霉素对PD小鼠的神经保护效应,雷帕霉素提高了 MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠中脑谷氨酸转运体GLT-1表达。同时雷帕霉素提高了 MPP+染毒星形胶质细胞和PD小鼠血清以及中脑IL-6的表达,雷帕霉素也显著降低了 PD小鼠血清中IFN-γ的表达水平。我们的研究为揭示EAATs的转运循环机制及其在PD中的调控机制提供了理论和实验基础。