论文部分内容阅读
第一部分5-羟色胺1A受体激动剂高通量筛选模型的建立抑郁症目前己成为世界第四大疾患,临床表现为情绪低落、悲观、睡眠障碍,严重者有自伤和自杀冲动。中枢去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺等单胺类神经递质含量过低及其受体功能低下等都被认为是引起抑郁症的原因。目前,由于生活压力日益增大以及一些家族基因遗传,抑郁症患者数量逐渐增多,这使得抑郁症成为全球公共健康中的一大主要问题。5-HT1A受体是5-HT受体家族中第一个被克隆出来的亚型。人类遗传学和图像学研究表明5-HT1A受体与焦虑症、抑郁症、精神分裂症等一系列精神疾病有关,目前临床研究表明,其激动剂能有效改善抑郁症和焦虑症。因此,开发和寻找5-HT1A受体的激动剂具有重要意义,而构建稳定表达人源5-HTIA受体是该受体激动剂筛选的重要方法和手段。本文中为了寻找5-羟色胺1A(5-HT1A)受体的激动剂,通过报告基因活性检测的方法建立高通量筛选(HTS)细胞模型。首先将带有人源5-HT1A受体的真核表达质粒pcDNA3.1(pcDN A3.1-h5-HT1AR)与带有报告基因pCRE-luc的pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-pCRE-luc)共转染到工具细胞中,通过对工具细胞的选择、共转染质粒的比例、化合物孵育时间及阳性化合物的选择等条件进行探索和优化,建立了一个可以稳定表达人源5-HT1A受体并可用于该受体激动剂筛选的细胞模型(HEK293-h5-HT1AR)。实验结果发现：根据瞬转实验中信号值的高低,采用HEK293细胞作为工具细胞；根据瞬转实验中的信噪比,实验发现pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc的最佳比例为1：3；对化合物孵育时间进行优化,选择的最佳孵育时间为6小时；阳性化合物的选择过程中,实验研究了5-HT.HC1, Flibanserin,8-OH-DPAT以及Lorcaserin(APD356)四个已报道有5-HT1A受体激动活性的化合物,最后结果表明APD356在该体系中最适合作为阳性化合物。基于以上条件,构建稳定表达5-HT1A受体的稳转细胞株,并对该细胞株进行12代的不定期检测,信号基本维持稳定。利用该模型,筛选了实验室的化合物,筛选到1个化合物,初步推测该化合物可能是5-HTIA受体的激动剂。因此本实验所建立的模型可用于高通量5-HT1A激动剂的筛选,对于抗抑郁药的发现具有一定研究价值。第二部分脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白的结晶脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4/AP2)是第一个被发现的脂肪酸结合蛋白,分布广泛,在脂肪细胞和巨噬细胞中表达较高。该基因的缺陷可以改善胰岛素抵抗,并且可以抑制动脉粥样硬化以及炎症的发生,因此,FABP4已成为治疗糖尿病以及粥样硬化的重要靶标。基于以上研究价值,研究人员积极寻找FABP4的新型小分子抑制剂。本实验室在体外筛选到系列FABP4巴标抑制活性较高的化合物,希望进一步了解其蛋白及小分子化合物的结合模式便于化合物的改造。本项研究主要借助大肠杆菌表达体系大量表达FABP4蛋白,并对该蛋白进行纯化,获得了纯度较高的FABP4蛋白,用于化合物和蛋白的共晶实验。