G蛋白门控的内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, GIRK)是内向整流钾通道家族中的一员,存在5种亚单位(GIRK1-5),它们与神经兴奋性和心率的调节有关,特别在维持神经元的静息电位及慢突触后抑制中起重要作用。GIRK通道的分子组成已经得到鉴定,是Kir3.x钾通道家族的成员。GIRK通道的功能除了受G蛋白的调节外,另外还受到磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)、细胞内的钠、乙醇及机械性牵张作用的调节。GIRK1和GIRK4主要分布在心房和窦房结细胞中,在调节心脏兴奋性中起重要作用,由迷走神经释放的递质乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)通过兴奋Ⅱ型毒蕈碱样受体(M2)以及下游的PTX敏感的Gi蛋白激活GIRK通道,引起膜动作电位超极化,减少动作电位的频率,减慢心率。GIRK2主要分布在中枢神经系统,许多神经递质如γ-氨基丁酸、多巴胺、5-羟色胺和阿片肽类等通过激活PTX敏感的Gi蛋白激活GIRK通道,调节神经细胞的兴奋性。已有研究表明,Gi/o偶联的受体激活后能够激活而Gq及Gs G蛋白偶联的受体激活后却不能激活GIRK通道,表明G蛋白偶联的受体在调节GIRK功能中有特异性。例如,在心肌组织中,只有与PTX敏感的G蛋白(Gi/Go)偶联的受体如M2毒蕈碱样受体,A1嘌呤能受体及EDG家族的神经鞘脂类受体能够激活GIRK通道,而与PTX不敏感的G蛋白(Gs)偶联的受体如β肾上腺素能受体却不能激活GIRK通道。研究表明Gi蛋白是通过激活后释放的Gβγ亚单位激活GIRK通道的,目前已发现了至少5种β亚单位和12种γ亚单位,然而,几乎所有不同组合形式的Gβγ亚单位均能激活GIRK通道,所以受体激活GIRK通道的选择性不能用Gβγ二聚体的不同组合类型来解释。我们前期工作表明Gα亚单位在受体激活GIRK通道的选择性中可能起重要的作用。本研究重点观察了Gα亚单位与GIRK通道的直接结合情况。在本实验中以非洲爪蟾卵母细胞为表达系统,研究了内源性Gα亚单位以及过表达Gα亚单位后Gα与GIRK4通道结合在一起。结果表明,爪蟾卵母细胞内源性Gαi/o亚单位确实与GIRK4通道相结合,而Gαq及Gαs亚单位却未与GIRK4通道结合。但当过表达Gαq及Gαs亚单位时,过表达的Gαq及Gαs能与GIRK4结合,本研究结果表明Gα亚单位可能是决定受体调节GIRK通道特异性的决定因素。一、FLAG标记的GIRK4通道的构建、表达及其对通道功能的影响目的:在GIRK4通道蛋白中加入FLAG标记短肽,表达于爪蟾卵母细胞。应用双电极电压钳技术检测标记有短肽的GIRK4的功能是否受到影响;应用免疫印迹技术进一步确认FLAG短肽是否成功加入GIRK4通道蛋白。方法:(1)构建重组质粒DNA:运用聚合酶链式反应(PCR)技术合成带有FLAG标记的GIRK4通道片段,产物大小约1300个碱基。使用限制性核酸内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ对FLAG-GIRK4 DNA片段及pGEMHE载体质粒DNA分别进行双酶切,酶切产物经纯化后,按照插入片段(FLAG-GIRK4 DNA片段)与载体(pGEMHE质粒DNA)的摩尔比为10:1的比例进行连接。将连接产物转化Top 10大肠杆菌感受态细胞后铺于氨苄抗性阳性的LB琼脂平板上,之后将挑取的数个单克隆提取质粒DNA并使用SmaⅠ和EcoRⅠ对其进行双酶切鉴定。挑取双酶切产物片段大小正确的多个克隆送测序公司测序,最后得到一个测序结果完全正确的克隆。(2)FLAG-GIRK4表达于爪蟾卵母细胞:使用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-T7 Kit体外转录得到FLAG-GIRK4、GIRK4和M2受体的cRNA,根据其表达情况按每个卵母细胞1-2ng/50nl注射,注射后的细胞在含2.5mM丙酮酸钠的ND96中19-20℃培养。使用双电极电压钳(two-microelectrode voltage clamp,TEVC)检测通道的表达情况。通道表达后,使用M2R激动剂乙酰胆碱(ACh)灌流,来检测其对GIRK4通道电流的激活程度。(3)验证FLAG标记确实与GIRK4通道蛋白融合: FLAG标记的GIRK4通道表达于爪蟾卵母细胞后,提取细胞膜蛋白并进行SDS-PAGE,通过使用抗-FLAG短肽的特异性抗体进行免疫印迹确认FLAG短肽已与GIRK4通道蛋白成功融合。结果:(1)成功构建重组质粒DNA,经过测序鉴定,确认FLAG标记短肽所对应的DNA碱基序列已经插入到GIRK4-pGEMHE的DNA碱基序列上游,从而成功构建了重组质粒DNA即FLAG-GIRK4-pGEMHE,经BLAST验证,未发现有碱基突变,所得重组质粒DNA序列与膜板序列完全吻合。(2)FLAG标记的GIRK4通道蛋白成功表达于爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳检测有通道电流,表达程度与对照相同,在灌流液中加入ACh,ACh对带有FLAG标记的GIRK4通道电流的增加程度与未标记FLAG的GIRK4通道电流相同,统计学无显著性差异(P>0.05)。(3)免疫印迹实验结果证实FLAG短肽确实已与GIRK4通道蛋白融合并有表达。结论:通过PCR技术已成功构建重组质粒DNA即FLAG-GIRK4-pGEMHE,且FLAG标记蛋白已稳定表达并且未影响GIRK4通道蛋白的功能。为下一步的实验奠定了坚实的基础。二、Gα亚单位与GIRK通道相互结合特性的研究目的:(1)比较爪蟾卵母细胞内源性Gα亚单位与Gβγ或GIRK通道结合的量的多少。(2)观察过表达Gα亚单位后其与Gβγ或GIRK通道的结合情况。方法:(1)以非洲爪蟾卵母细胞为表达系统,将FLAG标记的GIRK4通道(FLAG-GIRK4)、Gαq、Gαs、M1毒蕈碱样受体(M1R)及β2肾上腺素能受体(β2AR)的质粒线性化后体外转录为相应的cRNA。每个蛙卵细胞注射46nl含有Gαq亚单位、M1R、和FLAG-GIRK4通道cRNA的混合液,或注射Gαs亚单位、β2AR、和FLAG-GIRK4通道cRNA的混合液,注射后的细胞在含2.5mM丙酮酸钠的ND96中19-20℃培养,根据cRNA的表达情况,2-4天后即可进行双电极电压钳记录。(2)免疫印迹:匀浆器于冰浴匀浆蛙卵细胞,之后4℃,5000g离心5分钟,取上清4℃,200,000g离心1h,裂解缓冲液溶解所得沉淀。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并将内源性或过表达了Gα亚单位的蛙卵膜蛋白转移至PVDF膜。膜蛋白以1:1体积与2×上样缓冲液混匀上样,所用一抗分别为抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11、抗-Gαs/olf或抗-GAPDH的抗体,并分别孵育不同来源的二抗,最后使用DAB显色试剂盒显色。(3)免疫共沉淀:2-4μg抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11、抗-Gαs/olf或抗-FLAG的抗体分别加到相应的膜蛋白中4℃孵育过夜,次日加入20μl琼脂糖蛋白微珠A继续孵育2-5h。将混悬液于4℃,1000g离心3分钟,弃上清,使用500μl裂解缓冲液反复冲洗微珠3-5次,结合在微珠上的蛋白用20μl含有5%β-巯基乙醇的上样缓冲液洗脱,99℃加热变性5分钟放至室温后进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移凝胶上的蛋白至PVDF膜后3% BSA溶液封闭1小时,将相应的抗-Gβ、抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11、抗-Gαs/olf或抗-FLAG的一抗4℃孵育过夜,次日孵育相应的二抗,37℃,1小时,最后使用DAB显色试剂盒显色。结果:(1)蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位表达的量多于Gαi亚单位的量。与Gi/o偶联的受体能够激活而与PTX不敏感的G蛋白偶联的受体(Gq、Gs)不能激活GIRK通道的原因之一可能是Gq或Gs蛋白被激活后所释放的Gβγ亚单位的量远远少于Gi蛋白被激活后所释放的Gβγ的量,也就是说内源性的Gq或Gs蛋白少于Gi/o蛋白的量。因此,我们首先通过免疫印迹的方法对蛙卵内源性Gαi/o,Gαq及Gαs亚单位的量进行了比较。选用GAPDH作为内参照对Gα亚单位的量进行标准化。各亚单位的量分别通过抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11、抗-Gαs/olf及抗-GAPDH的一抗进行检测。结果显示蛙卵内源性Gαq或Gαs亚单位表达的量多于Gαi亚单位的量。(2)蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位结合的Gβγ的量多于Gαi亚单位结合的Gβγ的量。通过BCA蛋白检测试剂盒测定膜蛋白浓度后,将4μg抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11或抗-Gαs/olf的抗体分别加入三组含量相同的膜蛋白溶液中进行免疫共沉淀,使用抗-Gβ抗体进行免疫印迹来分析各Gα亚单位分别结合的Gβγ的量。光照成像后条带相对灰度使用Bio1D软件分析后显示,蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位结合的Gβγ的量多于Gαi亚单位结合的Gβγ的量。(3)蛙卵细胞内源性Gαi/o亚单位与GIRK4通道结合,而内源性Gαq或Gαs亚单位不与GIRK4通道结合。应用免疫共沉淀实验检测Gα亚单位与GIRK4通道的结合情况。抗-Gαi/o/t/z、抗-Gαq/11或抗-Gαs/olf的抗体进行免疫共沉淀实验,抗-FLAG抗体用于免疫印迹检测,结果表明蛙卵细胞Gαi/o亚单位与GIRK4通道结合,而Gαq或Gαs亚单位不与GIRK4通道结合。我们又将抗-FLAG抗体用于免疫共沉淀,而将抗-Gαi/o/t/z抗体用于免疫印迹的检测,同样显示阳性结果。(4)蛙卵细胞过表达外源性Gαq或Gαs亚单位后能与GIRK4通道结合。首先利用抗-Gαq/11或抗-Gαs/olf抗体进行免疫沉淀,抗-FLAG抗体进行免疫印迹;然后利用抗-FLAG抗体进行免疫沉淀,利用抗-Gαq/11或抗-Gαs/olf抗体进行免疫印迹。结果均显示过表达Gαq或Gαs亚单位后能与GIRK4通道结合。我们又通过免疫共沉淀实验比较了蛙卵内源性及过表达Gαq或Gαs亚单位后所结合的Gβγ的量的情况。结果表明过表达Gα亚单位后比内源性Gα能结合更多的Gβγ亚单位。结论:蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位表达的量多于Gαi亚单位的量。蛙卵细胞内源性Gαi/o亚单位与GIRK4通道结合,而内源性Gαq或Gαs亚单位不与GIRK4通道结合。蛙卵细胞过表达Gαq或Gαs亚单位后能与GIRK4通道结合并且过表达Gα亚单位后比内源性Gα亚单位能结合更多的Gβγ亚单位。总结1通过PCR技术已成功构建重组质粒DNA即FLAG-GIRK4-pGEMHE,且FLAG标记蛋白已稳定表达并且未影响GIRK4通道蛋白的功能。为下一步的实验奠定了坚实的基础。2蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位表达的量多于Gαi亚单位的量。3蛙卵细胞内源性Gαq或Gαs亚单位结合的Gβγ的量多于Gαi亚单位结合的Gβγ的量。4蛙卵细胞内源性Gαi/o亚单位与GIRK4通道结合,而内源性Gαq或Gαs亚单位不与GIRK4通道结合。5蛙卵细胞过表达Gαq或Gαs亚单位后能与GIRK4通道结合。6过表达Gα亚单位增加所结合的Gβγ的量。7过表达外源性Gα亚单位改变G蛋白偶联受体调节GIRK特异性的机制可能与增加Gα亚单位与GIRK非特异性结合有关。