本课题分三部分，分别从动物实验和临床的角度研究了急性创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的变化以及与caspase-3基因表达的关系。各部分研究摘要如下： 第一部分：大鼠头颅打击伤后神经细胞凋亡以及大剂量甲基强的松龙治疗作用的实验研究 目的 探讨急性创伤性脑损伤后神经细胞的凋亡和时序空间分布特点，以及大剂量甲基强的松龙对创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的影响。 方法 成年Spraque-Dawley大鼠232只，随机分为对照组8只，轻度脑损伤组、中度脑损伤组、重度脑损伤组和治疗组各56只。损伤组和治疗组经Feeney氏自由落体致伤方法致伤，治疗组伤后静脉内注射大剂量甲基强的松龙30mg／kg，分别在伤后1h、6h、24h、48h、72h、7d和14d处死取材(每个分析时相点8只大鼠)。各分析时相点分别采集伤灶中心皮质、伤灶皮层下白质、海马、齿状回，以及伤灶对侧相应部位新鲜脑组织，应用脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核甘酸缺口末端标记法(TUNEL)染色、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳、光镜和透射电镜等多种手段检测神经细胞凋亡的改变以及大剂量甲基强的松龙对神经细胞凋亡的影响。 结果 伤后光镜和透射电镜观察各分析时相点伤灶中心皮质主要显示为片状分布的坏死细胞，伤灶皮层下白质、海马和齿状回均见散在分布的凋亡神经细胞，且星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和神经元均发生了凋亡；凋亡神经细胞在伤后1h即出现，伤后48h和72h最多见，并持续到伤后14d。TUNEL染色结合电镜观察出现两种类型TUNEL阳性染色神经细胞，即表现为坏死细胞特点的Ⅰ型细胞和表现为凋亡细胞特点的Ⅱ型细胞；伤后1h伤侧脑组织即见少量的Ⅱ型TUNEL阳性神经细胞，峰值为伤后24～72h，持续时间均达伤后14d；凋亡神经细胞数量以中度脑损伤组较多，重度脑损伤组次之，轻度脑损伤组较少；各损伤组神经细胞凋亡指数(AI)伤后1h与正常对照组相比已有明显差异(P＜ 一 0刀5），伤后14 d仍高于正常水平o＜0刀5卜流式细胞仪检测发现，伤后各分析 时相点均可见凋亡特征性的亚二倍体核型峰沏峰h伤后伤侧各脑区细胞凋亡 百分率均迅速增高，伤后lh与正常对照组相比已有明显差异o＜o．01），48～72 h达峰值，随后逐渐下降，但伤后14 d仍高于正常水平O＜0刀1卜琼脂糖凝胶电 泳分析轻度脑损伤组伤后 6 h～7 d、中度和重度脑损伤组伤后 lh～14 d各分析 时相点挫伤灶皮层下白质和海马区DNA均出现凋亡特异性的“梯状”电泳带。 治疗组应用大剂量甲基强的松龙后，各分析时点和各脑区凋亡神经细胞数量较单 纯重度脑损伤组相应时点和脑区均明显减少；且伤后 lh、6 h、7 d和 14 d各脑 区神经细胞凋亡指数和细胞凋亡百分率与正常对照组相比均己无明显差异O＞ 0．05）；伤灶皮层下白质和海马区 DNA电泳除伤后 24 h、48 h和 72 h仍可见凋亡 带谱外，伤后 lh、6 h、7 d和 14 d均未发现凋亡带谱。 结论 急性创伤性脑损伤可导致神经细胞凋亡，凋亡程度与脑损伤程度有关，同 时凋亡细胞具有与坏死细胞明显不同的时序和空间分布特征。大剂量甲基强的松 龙能抑制急性创伤性脑损伤后的神经细胞凋亡。 第H部分：大鼠头颅打击伤后凋亡神经细胞caspase－3基因表达的实验 研究 目的 探讨急性创伤性脑损伤后c卿ase刁基因在InRN和蛋白水平表达的变化 规律及其与神经细胞凋亡发生发展的关系。 方洁 SD大鼠 120只，随机分为正常对照组 8只、损伤对照组和抑制物组各 56 只。Feeney氏自由落体致伤方法致伤，抑制物组伤后脑内注射spg c呷aseS的 选择性四肽抑制物Z－DEVD－for，损伤对照组注射等容量的人工脑脊液，分别在 伤后 lh、6 h、24 h、48 h、72 h、7 d和 14 d处死取材（每个分析时相点 8只大 鼠）。各分析时相点分别采集伤灶中心皮质、伤灶皮层下白质、海马、齿状回，工 以及伤灶对侧相应部位新鲜脑组织，利用兔疫组织化学技术、Western印记分析 法和逆转录PCR技术，检测c8Spase上蛋白和InRNA的表达；借助caspase3荧 光分析试剂盒，荧光比色法检测伤后c卿ase习活性的变化；同时，应用原位末 端标记和流式细胞术检测神经细胞凋亡的变化。 结果 伤后IU’to’－－ L染色出现两种类型n卫姬山阳性神经细胞，即表现为坏死细 胞特点的 1型细胞和表现为凋亡细胞特点的＊型细胞；伤后 lh伤侧脑组织即见 ’Z — — 少量的＊型 IUrM’－－L阳性神经细胞，峰值为 24～48 h，持续时间均达 14 d 流式 细胞仪检测发现，伤后各分析时相点均可见凋亡特征性的亚二倍体核型峰；伤后 伤侧各脑区神经细胞