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遗传不稳定（genetic instability）可表现为基因水平的微卫星不稳定（microsatellite instability，MIN）和染色体水平的染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）。其发生机制包括DNA复制保真度降低（DNA聚合酶），DNA修复系统障碍（包括BER、NER、MMR、HR、NHEJ），细胞周期DNA损伤校正点缺陷（P53，DNA-PK，ATM等），端粒酶和端粒改变，以及外遗传机制（epigenetic mechanism）如甲基化。在一系列家族癌综合症中，这些机制多有较深入的研究。如遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary non polyposis colorectal cancer，HNPCC）中MMR途径hMSH2，hMLH1，hPMS1和hMPS2基因突变；着色性干皮病（xeroderma pigmentaosa）患者DNA切除修复系统遗传性缺陷；毛细血管扩张性共济失调（ataxia telangictasia）中，细胞周期DNA损伤校正点信号传导蛋白ATM突变；以及多种肿瘤抑制基因启动子区甲基化所致表基因沉默。遗传不稳定不仅成为肿瘤生物学和临床医学的研究热点，在遗传学和遗传毒理学也已积累了大量资料。环境致突变／致癌物除了通过直接损伤DNA外，还可通过诱发细胞内遗传不稳定状态而导致突变事件发生。细胞在受到离子辐射、致癌物（如烷化剂）攻击后，可产生细胞延迟发生的遗传不稳定，包括延迟发生的增殖性死亡、克隆能力的下降，延迟发生的染色体重排、畸变以及延迟发生的点突变。即DNA损伤剂除了能直接作用于细胞遗传物质而造成损伤部位的定标性突变（targeted mutation，TM）外，还可能通过诱导某些基因的表达或功能改变导致DNA复制差错，从而在未损伤部位形成非定标性突变（non targeted mutation，NTM）。非定标性突变是外源性DNA损伤剂造成基因组遗传不稳定的结果。 余应年等曾以穿梭质粒为探针，用DNA损伤剂甲基亚硝基胍（MNNG）在猴肾Vero细胞中诱导了非定标性突变。并在国家自然科学基金连续资助的工作基础上提出有关以非定标性突变为特征的遗传不稳定的发生机制模式。即化学致癌物→DNA损伤和非DNA 浙江大学博士研究生论文损伤性应激一细胞信号转导途径激活一基因表达改变一DNA聚合酶谱改变一DNA复制保真度降低一细胞遗传不稳定一基因非定标突变形成。本论文即重点探讨低浓度化学致癌物MN’NG通过DNA损伤和／或非DNA损伤途径，对信号转导途径的影响。由于我们所用的低浓度化学致癌物刺激所造成的细胞反应更接近现实环境中的化合物刺激，因而更具有实际意义。 由于非定标性突变不是DNA直接受攻击的结果，在损伤部位到突变部位之间必然存在特定的联系。这种联系是否属于常见的蛋白质磷酸化级联反应，是何种类型的磷酸化反应？余应年等发现可激活分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein klnase，MAPK）的蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHM）不仅不抑制MNNG诱发的非定标性突变，反而促进发生。采用产P］体内预标记及凝胶双向电泳方法差异显示蛋白斑点的分子量和印迹杂交试验结果，认为所见蛋白斑点可能为丝／苏氨酸磷酸化蛋白，且可能为MAPK成员。 不同应激原如何启动MAPK家族信号转导通路也有待证明。多种应激原，如紫外线 （UV）、X线、烷化剂、抗肿瘤药等都能造成 DNA损伤，由此引出的问题是，激活 MAPK等信号转导通路的信号是直接来自膜上？还是由核内损伤部位发出的信号返回膜上？ 结合以上工作，本论文着重研究探讨以下3个问题：①MAPK超家族中JNK／SAPK和 P38 MAPK对非定标突变的贡献。②JNK／SAPK、P38 MAPK信号转导通路的信号源是直接来自膜上？还是由核内损伤部位发出的信号返回膜上？MNNG如何启动MAPK家族信号转导通路。③如果＊＊＊K通路激活依赖于核内事件，则低浓度MN’N G能否造成＊＊A损伤？其损伤信号的介导与MAPK 的关系以及最终对细胞周划的影响怎样？l．MNNG对哺乳类细胞 JNK／SAPK及 P38 MAPK信号通路的作用及其信号源研究 为了评估低浓度MN’NG处理猴肾Wro细胞引起的胞内 川HSAPK通路和 P38MAPK通路反应的情况．我们用诱导非定标突变相同剂量0．ZpM MN’NG和相同时间2．5小时，刺激 Vero细胞，发现 eKjSAPK通路明显抑制（活性为对照 DMSO组的 0．引倍）：P38 MAPK在相同条件刺激下被激活（活性为对照 DMSO组的 1．47倍）。 为了判断 JNK／SMK、P38 MAPK信号转导通路的可能信号源，我们检测了相同条件处理下的脱核细胞反应。脱核细胞经Giernsa染色证实至少95％的细胞已被有效去核。实验发现在无核细胞中，MNNG引起的JNK抑制一如在完整细胞。JNK／SAPK在MN’NG处理后活性为对照DMSO组的0．45倍。说明MNNG对川K途径的抑制并不需要核物质 4 浙江大学博土研究生论文的参与。但是否能完全排除基因组DNA损伤作为JNK途径起源的可能，尚值得进一步研究。至少在Vero细胞，在MN’NG作用2．sh这个时间点上，JNK的抑制不需要核内信号。当然，该实验结果不能排除MN’NG对线粒体DNA损伤引起的反应，但至少说明该作?