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皮肤黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤,对高级别的黑素瘤临床常规治疗效果不佳。免疫治疗尤其是联合免疫治疗是国内外研究的热点,其中PD-1通路和Tim-3通路起负性免疫调节作用,参与肿瘤的免疫逃逸,其相关的免疫药物已经在黑素瘤的治疗中显示了很好的临床疗效。本研究探讨体外联合Tim-3Ig和PD-1Ig对TRP-21so-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响,为黑素瘤的免疫治疗提供理论基础和实验依据。第一部分Tim-3Ig真核表达载体的构建及表达目的构建Tim-3Ig真核表达质粒并获取含Tim-3Ig、PD-1Ig和Ig-tail的上清,为后续实验做好准备。方法生物信息学方法分析小鼠Tim-3分子结构,优化基因表达序列,将合成的序列连接至载体质粒,构建Tim-3Ig重组质粒,进行酶切及测序验证,用脂质体方法转染质粒至人肾上皮细胞293T中,收取上清进行蛋白免疫印迹(western blot)检测,细胞进行激光共聚焦检测,分析蛋白表达情况,并制备含Tim-3Ig的上清。用本课题组已经制备保存的pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2和pFUSE-PD-1-mIgG2Aae1-Fc2质粒采用相同方法制备含Ig-tail和PD-1Ig的上清。结果预测小鼠Tim-3分子1-19为信号肽,20-193为胞外域,194-214为跨膜域。酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中,western blot和激光共聚焦检测到转染重组质粒在293T中的表达。结论成功构建小鼠Tim-3Ig基因真核表达质粒且能在真核细胞中表达,并为后续研究提供含Tim-3Ig、PD-lIg和Ig-tail的上清。第二部分TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL6小鼠及B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系的构建目的构建B16F10细胞与TRP-218o-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系,为后续实验做好准备。方法以全部硫代修饰的CpG-ODN1826和弗氏不完全佐剂为佐剂构建TRP-218o-188肽疫苗,并对C57BL／6小鼠进行3次初次免疫及1次加强免疫,取其脾淋巴细胞并进行TRP-2180-188抗原肽体外刺激,与小鼠黑素瘤B16F10细胞体外共培养。结果 体外经TRP-2180-188抗原肽刺激的脾淋巴细胞随培养时间延长,逐渐出现集落性增殖,并且出现体积增大、胞核大、胞浆丰富的细胞；与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的脾淋巴细胞随培养时间的延长,逐渐出现向B16F10细胞周围聚集的现象。结论 成功构建B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系。第三部分Tim-3Ig联合PD-lIg对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响目的探讨Tim-3Ig联合PD-1Ig对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。方法在小鼠黑素瘤B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽特异性刺激的小鼠脾淋巴细胞共培养体系,实验设五组：空白对照组、阴性对照组、PD-1Ig组、Tim-3Ig组、Tim-3Ig联合PD-lIg组,CCK-8法检测24h、48h时淋巴细胞增殖情况,ELISA检测24h、48h上清中INF-γ、TNF-α分泌情况,流式细胞仪分析24h、48h时CD8+T淋巴细胞频率。结果Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h淋巴细胞增殖活性与对照组、PD-1Ig组无显著性差异(P>0.05),高于Tim-3Ig组(P<0.05)；48h增殖活性低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h、48h上清中IFN-γ和TNF-α浓度均低于其他各组(P<0.05)。Tim-3Ig联合PD-1Ig组24h、48hCD8+T淋巴细胞频率低于PD-1Ig组、Tim-3Ig组(P<0.05),高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论体外Tim-3Ig联合PD-1Ig对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的TRP-2180-188抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的增殖和IFN-γ、TNF-α分泌起抑制作用。