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本文利用大肠杆菌蛋白质合成硒代半胱氨酸的掺入机制,在大肠杆菌中直接表达出含有硒代半胱氨酸的单链抗体。
选择将单链抗体重链CDR2区中的Ser52突变成Sec52,将最小SECIS引入2F3的基因中,替换位于Ser52密码子下游11个核苷酸后的17个核苷酸。为了考察含有硒代半胱氨酸的单链抗体的表达,利用PCR扩增得到四种基因:
1.不含有任何突变的2F3基因,命名为F;
2.含有硒代半胱氨酸密码子UGA突变的2F3基因,命名为FT;
3.含有最小SECIS突变的2F3的基因,命名为FS;
4.含有UGA和最小SECIS两处突变的2F3基因,命名为FTS。
首先将这四种基因重组至表达载体pET21a(+)中,并对其进行了表达。同时在含有表达载体的宿主菌中转化了质粒pSU以帮助Sec的表达。经放射自显影检测,发现含有双质粒的菌株BL(DE3)-pEFTS/pSU经诱导后,表达出了含有Sec的单链抗体——2F3(TS),而菌株BL(DE3)-pEFTS经诱导后则没有表达出目的蛋白。这说明目的蛋白——2F3(TS)在大肠杆菌中得到了表达,但是表达量很低,而质粒pSU的存在提高了硒蛋白的表达量。我们试图通过大量表达菌体,对其包涵体洗涤而获得目的蛋白,但是没有成功。