目的本研究拟运用已构建好的携有血管内皮细胞生长因子启动子（VEGFP）并含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因和Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的重组腺病毒（Ad）载体，同时配制脂质体与survivin反义寡核苷酸转染复合物，在体外和体内分别感染大肠癌Lovo细胞，以研究Ad-VEGFP-CDglyTK基因治疗系统及survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤作用和体内抑瘤作用。一方面通过survivin反义寡核苷酸抑制survivin表达，诱导分泌大肠癌细胞凋亡，并消除血管内皮生长因子（VEGF）在血管形成中的细胞保护作用，导致内皮细胞凋亡和毛细血管迅速退化；另一方面通过VEGF启动子介导双自杀基因选择杀伤分泌VEGF的大肠癌细胞，减少VEGF的分泌，通过两者的协同作用抑制肿瘤的生长。方法一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究运用脂质体将不同浓度的Survivin ASODN转染Lovo细胞，用MTT法测定细胞存活率，采用RT-PCR方法测定survivin mRNA的表达状况，Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达，并用流式细胞仪检测survivinASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究复苏和扩增含有荧光蛋白（GFP）报告基因重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK，再用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒，并进行重组腺病毒的滴度测定，然后感染大肠癌Lovo细胞，给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）进行作用一定的时间，测定重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞转染效率、细胞存活率及旁观者效应，并进行细胞形态学观察，然后重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用观察大肠癌Lovo细胞的增殖及凋亡。三、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究将Lovo细胞接种于4周龄BALB／C裸鼠皮下建立裸鼠大肠癌移植瘤动物模型，当肿瘤达0.5cm直径时，将荷瘤裸鼠随机分组，并分别注射相应的survivin反义寡核苷酸及重组腺病毒，再向动物模型腹腔内注射5-FC和GCV，测量实体瘤重量变化、计算抑瘤率，治疗结束后取肿瘤组织进行HE染色观察病理学变化，免疫组化法检测微血管密度。结果一、Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．细胞成活率的测定不同浓度的Survivin反义寡核苷酸，Survivin正义寡核苷酸和空白对照转染大肠癌Lovo细胞后得到的细胞成活率，结果经单因素方差分析，Survivin ASODN组与Survivin SODN组、空白对照组比较，差异显著（P＜0.05），有统计学意义，说明Survivin ASODN与其他两组相比对大肠癌细胞有明显的抑制作用，而另两组间无统计学差异（P＞0.05）。Survivin ASODN在400ng／ml浓度时，对大肠癌细胞的抑制作用最明显。2．RT-PCR检测Survivin ASODN对Lovo细胞mRNA表达的影响RT-PCR产物电泳显示，对照组和处理组均出现特异性的Survivin条带，Survivin ASODN各组Survivin mRNA的表达明显低于空白对照组、脂质体组和Survivin SODN组等三组，经凝胶图像分析仪分析结果显示：空白对照组、脂质体组和SODN组之间无显著性差异（P＞0.05），ASODN各组和上述三组的Survivin／GADPH，差异具有显著性（P＜0.05），其中以400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组与上述三组差异最为显著。3．Western blot方法检测大肠癌Lovo细胞survivin蛋白的表达western blot检测表明：空白对照组、脂质体组和SODN组之间，Survivin蛋白表达无明显性差异（P＞0.05），200ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达略有降低，400ng／ml ASODN组及800ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达较空白对照组、脂质体组和SODN组明显降低，有统计学意义（P＜0.05），其中400ng／ml ASODN组转染后Survivin蛋白表达为16.33±1.48。4．流式细胞仪检测survivin ASODN对大肠癌Lovo细胞周期的影响流式细胞仪检测发现：实验各组凋亡峰分别为：（0.91±0.29）％、（0.87±0.22）％、（18.56±2.80）％和（30.47±1.73）％，ASODN组与空白对照组、SODN组有显著差异（P＜0.05），提示survivin ASODN能够大量诱导细胞凋亡。G₁期细胞分别为：（75.22±2.13）％、（72.17±2.63）％、（43.24±2.75）％和（9.37±2.67）％，各转染组G₁期细胞显著减少。各组S期细胞无明显变化，无统计学意义。G₂／M期细胞分别为：（4.46±1.44）％、（5.43±1.43）％、（13.40±2.04）％和（39.85±2.66）％，ASODN组较空白对照组、SODN组G₂／M期细胞显著增加（P＜0.05），出现G₂／M期阻滞现象，并且survivin ASODN能够以剂量依赖的方式诱导大肠癌Lovo细胞发生G₂／M期阻滞。二、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌Lovo细胞的体外杀伤实验研究1．重组腺病毒体外转染Lovo细胞的转染效率观察发现：Lovo细胞转染重组腺病毒后在荧光显微镜下呈现绿色荧光，未转染的细胞则无着色现象。采用不同MOI的重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK分别转染Lovo，发现重组腺病毒对Lovo细胞的转染效率随腺病毒滴度的增加而递增，当MOI=100时，90％以上的GFP表达，说明本实验室构建的重组腺病毒体外转染效率高，目的基因能有效地得以表达。2．MTT法检测重组腺病毒对大肠癌Lovo细胞存活率MTT法检测细胞成活率结果提示：用不同浓度的5-FC、GCV或者5-FC+GCV治疗后，重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK转染后肿瘤细胞的存活率随药物浓度增加均呈逐渐下降趋势，即对前药的作用呈浓度依赖性。单用浓度1μg／ml的GCV时，细胞存活率为（56.47±2.39）％，单用浓度为40μg／ml的5-FC，细胞存活率为（53.35±2.20）％，二者联合时，细胞存活率分别为（27.23±1.46）％，提示在5-FC和GCV浓度固定的情况下，单一前药和双前药作用下的细胞存活率相比，有显著性差异（P＜0.05）。3．旁观者效应旁观者效应结果如下：重组腺病毒按不同比例转染Lovo细胞，在20％的混合比例，GCV组细胞存活率为（65.25±1.58）％，5-FC组细胞存活率为（63.63±1.71）％，GCV+5-FC组细胞存活率为（45.60±2.07）％，它们均显著低于对照组（P＜0.05），GCV组与5-FC组无明显差异。我们观察到随着转染病毒Lovo细胞所占比例的增加，细胞存活率逐渐降低，转染病毒组与对照组均有显著差异（P＜0.05），GCV+5-FC组较GCV组与5-FC组亦有显著差异（P＜0.05），提示CD与TK自杀基因具有旁观者效应，VEGF启动子驱动的双自杀基因旁观者效应更强，并呈现协同效应。4．药物作用后电镜的观察电镜下观察：可见部分细胞体收缩、染色质边聚，有的胞核形态不规则，核发生碎裂，胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片，有的可见凋亡小体（或整个凋亡细胞）被吞噬和降解的现象，同时见部分细胞呈坏死表现。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因与Survivin ASODN联合作用对Lovo细胞增殖的影响各实验组作用24h后，细胞存活率分别为：空白对照组（98.35±1.22）％、Survivin ASODN组（62.49±2.47）％、Ad-VEGFP-CDglyTK组（69.43±1.49）％、ASODN+Ad-VEGFP-CDglyTK组（31.48±2.38）％，空白对照组与其他三组均有显著性差异（P＜0.05），基因联合治疗组细胞存活率较Survivin ASODN组及Ad-VEGFP-CDglyTK组亦明显降低，有统计学意义（P＜0.05），提示Survivin ASODN与VEGF启动子驱动的双自杀基因对于大肠癌Lovo细胞的抑制，具有有协同作用。6．重组腺病毒与survivin ASODN的联合作用对细胞凋亡的影响流式细胞仪检测显示：单独应用Survivin ASODN的Lovo细胞的凋亡率为（19.55±2.38）％，单独应用Ad-VEGFP-CDglyTK的Lovo细胞的凋亡率为（21.83±2.23）％，两者联合应用的Lovo细胞的凋亡率为（38.53±2.30）％，三者均能促进Lovo细胞的凋亡作用，与空白对照组有显著差异（P＜0.05）。Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组相比没有明显差异（P＞0.05）。Survivin ASODN与Ad-VEGFP-CDglyTK二者联合应用较Survivin ASODN及Ad-VEGFP-CDglyTK处理组差异显著（P＜0.05），有统计学意义，提示Survivin ASODN和Ad-VEGFP-CDglyTK两者对于大肠癌Lovo细胞的凋亡具有协同作用。三、VEGF启动子驱动的双自杀基因联合Survivin反义寡核苷酸对大肠癌裸鼠体内抑瘤作用的实验研究1．荷瘤裸鼠肿瘤生长及基因联合抑瘤作用Lovo细胞接种裸鼠皮下4-5天后，陆续可在皮下摸到粟粒样大小肿瘤结节，至接种后第12天，所有被接种裸小鼠均出现结节，移植成功率为100％。裸鼠成瘤达0.5cm后开始分组治疗，四组初始瘤体体积方差分析无显著差异（P=0.389）。治疗结束时最终瘤重及抑瘤率分别为：空白对照组（516.58±10.58）mg；重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组（238.74±15.77）mg，（53.78±3.12）％；Survivin ASODN组（225.61±13.47）mg，（56.23±2.60）％；基因联合治疗组（63.70±3.41）mg，（87.66±0.70）％。空白对照组与其他三组差异显著（P＜0.05），基因联合治疗组与另外两组比较亦差异显著（P＜0.05），提示Survivin ASODN及VEGF驱动的双自杀基因均具有抑瘤作用，但二者联合治疗抑瘤作用更为明显，具有协同作用。2．移植瘤瘤体病理变化常规病理下见肿瘤细胞生长受抑制，特别是基因联合治疗组抑瘤作用最明显，肿瘤组织切片中可见片状坏死区，而且这些区域可见大量炎性细胞浸润。3．微血管密度的检测检测肿瘤组织MVD发现：空白对照组MVD为19.25±3.19、重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组MVD为11.33±2.46、Survivin ASODN组MVD为10.42±2.35、基因联合治疗组MVD为3.33±1.56，空白对照组MVD明显高于其他三组（P＜0.05），重组腺病毒Ad-VEGFP-CDglyTK组及Survivin ASODN组MVD均高于基因联合治疗组，并有显著差异（P＜0.05）。结论1．Survivin ASODN转染大肠癌Lovo细胞，阻碍了survivin mRNA转录及翻译的过程，survivin蛋白表达下降。2．Survivin ASODN可以抑制大肠癌Lovo细胞的增殖，且随浓度增加，其对细胞的抑制作用更明显。3．Survivin ASODN封闭survivin基因的表达，可诱导结肠癌Lovo细胞的凋亡。4．VEGF启动子驱动的双自杀基因对大肠癌Lovo细胞具有明显的体外杀伤作用，其杀伤作用强于单自杀基因。5．VEGF启动子驱动的双自杀基因作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应，表现为处理后抑制靶细胞的增殖及诱导靶细胞的凋亡。6．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸联合应用在体外实验中，对抑制大肠癌Lovo细胞的增殖和诱导细胞凋亡过程起协同作用。7．VEGF启动子驱动的双自杀基因和Survivin反义寡核苷酸均具有一定的体内抑瘤作用，而且二者联合应用，对于肿瘤的抑制作用更加显著，具有协同作用。