本课题以泌乳奶牛乳腺组织为原材料，比较几种不同收集乳腺上皮细胞的方法，从中选择一种比较合适的方法，做为后续研究的基础。在此基础上，通过体外培养研究小肽和游离氨基酸以及赖氨酸和蛋氨酸比例对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白α<,Sl>基因表达的影响。 1．乳腺上皮细胞收集方法的比较研究采用三种不同的方法(酶消化、机械分离、组织块培养)收集乳腺上皮细胞进行体外培养，三种不同的方法收集的乳腺细胞连续培养7天，从第二天开始测MTTOD值，以此反映三种方法收集的乳腺细胞在体外培养过程中的生长增殖情况。 结果表明：胶原酶消化收集的乳腺上皮细胞在随后的培养过程中活性很低，不能正常生长和增殖。通过机械分离的方法分离乳腺组织时，分离得到的单个细胞相对较少，主要以细胞团的形式分离出来，这些细胞团形式存在的细胞，在培养过程中不容易贴壁，悬浮在培养液当中，导致其在随后的培养过程中活性也很低。组织块培养的方法收集的乳腺上皮细胞在培养过程能正常生长与增殖，并且出现了“拉网”、“圆顶状”等上皮细胞样结构，收集的细胞在MTI细胞增殖试验中其OD值在培养5天后要显著高于其它两种方法收集得到的细胞(P<0.01)，而且OD值的曲线呈“S”形，符合细胞生长和增殖的规律。 2．蛋氨酸和二肽对体外培养酪蛋白基因表达的影响采用组织块培养的方法收集奶牛乳腺上皮细胞，通过添加不同浓度的蛋氨酸，等量的蛋氨酸与蛋氨酸二肽以及蛋氨酸、赖氨酸与蛋氨酸赖氨酸二肽之间的替换，研究其对体外培养的乳腺上皮细胞酪蛋白α<,sl>基因表达的影响。蛋氨酸添加水平为0、20、40、60、80和100μg/ml。结果表明：添加蛋氨酸的浓度低于60μg/ml时酪蛋白α<,sl>基因表达随蛋氨酸浓度的增加而增强，随后酪蛋白α<,sl>基因表达随蛋氨酸浓度的增加而减弱，添加蛋氨酸为60μg/ml时基因表达最强，与0μg/ml组间差异显著(P<0.05)，其余各组间差异均不显著；用60μg/ml蛋氨酸二肽或120μg/ml蛋氨酸赖氨酸二肽替代等量的游离氨基酸时，添加二肽组乳腺上皮细胞酪蛋白α<,sl>基因表达要极显著高于添加游离氨基酸组(P<0.01)，同时变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，添加小肽组培养液中酪蛋白的浓度高于添加相应的游离氨基酸组。从上述结果可以说明乳腺上皮细胞可以利用蛋氨酸二肽和蛋氨酸赖氨酸二肽，而且其利用效率高于利用游离蛋氨酸的效率。为了研究影响酪蛋白α<,sl>基因表达的最佳蛋氨酸二肽添加量，在培养液中添加60、70、80、90、100和110μg/ml蛋氨酸二肽，培养结果显示：添加蛋氨酸二肽浓度在70μg/ml时酪蛋白α<,sl>基因表达到最大值，除了与添加60μg/ml组差异不显著外与其它各浓度组间差异均显著(P<0.05)。当蛋氨酸二肽的添加浓度高于70μg/ml，随着添加量的增加酪蛋白基因表达反而下降，但各组间差异不显著。表明蛋氨酸二肽与蛋氨酸一样有一个理想的添加浓度。 3．赖氨酸与蛋氨酸比例对酪蛋白α<,sl>基因表达的影响通过体外培养，探讨赖氨酸与蛋氨酸比例对酪蛋白α<,sl>基因表达的影响。培养液中赖氨酸、蛋氨酸(57μg/ml)添加比例为1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1和4.5：1(每组三个重复，5×10<4>个/孔)，培养48小时后，用胰蛋白酶和EDTA消化贴壁培养的细胞，通过构建的RT-PER方法检测体外培养乳腺上皮细胞酪蛋白α<,sl>基因表达丰度。结果表明，当赖氨酸和蛋氨酸的比例在1：1-3.5：1时，随着比例的升高酪蛋白α<,sl>基因表达有上升的趋势，当比例高与3.5：1时，酪蛋白α<,sl>基因表达略有下降。赖氨酸和蛋氨酸比例在1：1-2.5：1的各组与比例在3：1-4.5：1组之间酪蛋白α<,sl>基因表达差异显著(P<0.05)，其余各组间差异均不显著。 综上所述：采用组织块培养的方法收集的乳腺上皮细胞，在培养过程中能正常生长，可以用于体外培养研究；在体外培养体系中添加蛋氨酸二肽和赖氨酸蛋氨酸二肽，比添加相同含量的游离氨基酸更能促进乳腺上皮细胞酪蛋白α<,sl>基因表达；改变培养液中赖氨酸和蛋氨酸的比例能影响酪蛋白α<,sl>1基因的表达，当两者比例在3.5：1时，酪蛋白α<,sl>基因表达最强。