组织工程血管在血管搭桥、急性血管损伤修复等血管替代治疗中具有广泛而重要的应用价值。但是,小口径组织工程血管(< 6 mm)移植后,常会因为早期的血栓形成等而导致移植失败,故血栓形成和内膜增生已经成为组织工程血管发展的瓶颈。目前在人工血管、血管内支架表面进行抗凝修饰能一定程度抑制血栓形成,但植入血管需终生使用,其长期的抗凝效果不甚理想。而内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子以及抑制平滑肌病理性增殖等方面有着重要作用。因此人工血管、组织工程血管内皮化是克服小直径血管血栓形成的有效方法,而内皮祖细胞为组织工程血管在体内皮化提供了新的机遇。内皮祖细胞(EPC)是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,血液中内皮祖细胞含量增高时能直接修复损伤的血管,其机制在于内皮祖细胞能直接种植于血管损伤部位,分化成内皮细胞替代和修复血管损伤部位的内皮,进而减少内膜增生,减少血栓形成,降低血管的再狭窄率。由于在生物体内,血管和神经常常形成血管神经束相伴前行,血管和神经的生长方式非常相似,它们循着相同的迁移路线,相互依赖,血管的活动和营养受神经调节。但是目前在构建血管组织工程时尚未引入神经调节因素,这种因素对构建功能完整的组织工程血管起何种促进作用尚不得而知。神经营养因子是重要的神经因素,对血管内皮维持正常功能有重要作用。神经营养因子中最具代表性的NGF是一个多功能多肽分子,NGF与内皮细胞上的TrkA结合可以触发内皮细胞的增殖、迁移,并上调内皮细胞粘附分子的表达,促进血管发生。但是,NGF是否能够促进EPCs的动员、归巢从而推进组织工程血管的内皮化还不清楚。基于此,本研究旨在证明NGF是否能够在体诱导EPCs的动员和归巢并且有效促进组织工程血管的内皮化。主要研究结果如下:1.用CD133磁珠从人外周血中分选出内皮祖细胞,利用甲基纤维素半固体培养基对内皮祖细胞进行单克隆培养,发现NGF能够显著促进EPCs的单克隆形成,但是这一效应并不是通过Akt通路发挥作用的。RT-PCR发现内皮祖细胞上表达的NGF受体是Trk A而不是P75。Real-time PCR进一步证明NGF能够促进内皮祖细胞表达CD31、VE-钙黏蛋白,说明NGF促进了内皮祖细胞向内皮细胞分化。2.通过MTT实验发现NGF促进了EPCs的增殖,并且是通过Akt这一通路起作用的。运用Transwell小室将内皮祖细胞接种于上室,下室培养基中加入NGF,24小时后用结晶紫染迁移到下室的内皮祖细胞,发现NGF能够诱导内皮祖细胞的迁移,并且通过阻断Akt通路可以抑制这一效应。3.为了研究NGF对损伤后C57BL/6小鼠骨髓中EPCs的动员作用,我们在C57BL/6小鼠铁丝损伤后连续3天腹腔注射NGF因子,然后利用流式细胞技术检测从骨髓动员到外周血中的EPCs数量。结果显示NGF不仅能够促进铁丝损伤后C57BL/6小鼠EPCs的动员,而且NGF能够对VEGF在EPCs动员过程中的促进作用起到协同效应。4.为了检测NGF对EPCs归巢的作用,从人外周血中经CD133磁珠分离的EPCs用NGF作用18小时后用CM-dil和钙黄绿素标记后经鼠尾静脉注射到颈总动脉铁丝损伤3天后的C57BL/6小鼠体内,2天后手术取出铁丝损伤的颈总动脉剖开暴露内膜腔面,经激光共聚焦显微镜观察注射入小鼠体内的EPCs的归巢到损伤部位的情况,发现NGF能够促进内皮祖细胞归巢到颈总动脉受损部位。5.运用脱细胞技术脱去大鼠颈总动脉细胞,表面孵育胶原后用EDC交联,再通过SPDP偶联NGF于血管腔面,以端端吻合移植于大鼠颈总动脉,一个月后发现NGF偶联组血管通畅率显著高于对照组,血管内皮化的程度也明显提高。以上结果表明,NGF可以促进内皮祖细胞的增殖、分化、迁移以及单克隆形成,并且在体验证NGF能促进C57BL/6小鼠自体内皮祖细胞的动员和归巢。偶联了NGF的组织工程血管通畅率和内皮化程度明显提高。