肝细胞癌(HEpatocellular carcinoma,HCC)是世界上五大常见的恶性肿瘤之一,发病率居全球第6位,位列肿瘤相关死亡原因的第3位。其起病隐匿,往往进展至晚期阶段才被发现。HCC发生发展的生物学机制仍不清楚,目前手术切除是治疗HCC唯一有效方法,但切除术后的高转移率和高复发率严重影响其预后。因此对HCC的发病机制研究一直是全球研究的热点,其过程是多因素多阶段多基因变异共同作用的病理过程。研究表明,细胞凋亡和增殖贯穿于其发生发展的全过程,涉及多种抑制细胞凋亡的基因高度表达、异常激活及诱导细胞凋亡的抗癌基因异常失活。目前认为,细胞凋亡抑制在HCC的发生发展中发挥重要作用。BCL2L10(Bcl2-like-10)是在分离新型BCL-2同源基因时被发现的由204个氨基酸组成的多肽,蛋白质分子量23kDa。BCL2L10属于BCL-2家族成员,广泛表达于人类组织中。BCL-2家族是进化上保守的细胞凋亡的关键性调节者,其通过促凋亡或抗凋亡在正常胚胎发育、组织内稳态和多种病理状态下发挥不可替代的作用。根据对细胞凋亡的影响BCL-2家族分为两类:抗凋亡家族成员和促凋亡家族成员,前者抗凋亡的作用受后者的拮抗。作为BCL-2家族中最晚被鉴定出来的成员,BCL2L10 mRNA在正常人骨髓、肝脏、脑、肺组织中表达量较高。最初认为BCL2L10与BCL-2一样同属于抗凋亡家族成员。有研究发现在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠腺癌和非小细胞肺癌中BCL2L10肿瘤特异性表达上调。然而最近有研究报道,与非癌胃粘膜组织相比BCL2L10在胃癌组织中表达下调,过表达BCL2L10可促进胃癌细胞凋亡、抑制其增殖,发现BCL2L10作为肿瘤抑制因子在胃癌发生中发挥重要作用。基础研究指出,BCL2L10这种在不同癌组织中发挥截然相反作用的能力,可能是由于其可根据不同的组织环境和细胞类型发挥出不同的作用有关。尽管有研究发现BCL2L10在正常人肝组织表达相对较高,但目前尚缺乏其在HCC中表达与作用的研究。为了阐明BCL2L10在HCC中的作用,本文中我们首先比较了BCL2L10在人HCC及其癌旁组织中的表达以及其在不同HCC细胞系及人正常肝细胞的表达;其次通过与肿瘤增殖、凋亡、转移相关的体内外功能实验,发掘BCL2L10在HCC中的功能作用;最后应用人类癌症通路芯片及验证实验探索BCL2L10在HCC作用的分子机制。第一部分BCL2L10在肝细胞癌组织及细胞中的表达目的:分析对比BCL2L10在人HCC组织及其癌旁组织中的表达以及其在不同HCC细胞系及人正常肝细胞的表达。方法:收集河北医科大学第二医院肝胆外科2014-5至2015-6行外科手术治疗的HCC患者的HCC组织及其癌旁组织42对。应用realtimepcr检测42对HCC患者HCC组织及癌旁组织中BCL2L10的表达;BCL2L10mrna在HCC组织较其癌旁组织表达降低的30对标本中应用westernblot分析检测BCL2L10蛋白的表达水平;应用HE和免疫组化染色观察BCL2L10在HCC及其癌旁组织中的表达;应用反转录pcr(rt-pcr)及realtimepcr分别检测BCL2L10mrna在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7和smmc7721共5种HCC细胞系、正常人肝细胞lo2及1对HCC组织及配对癌旁组织中的表达;应用westernblot方法检测BCL2L10蛋白在HepG2、Huh7、smmc7721共3种HCC细胞系、正常人肝细胞lo2、1对HCC组织及其配对的癌旁组织中的表达。结果:1在42对患者标本中有30个HCC组织BCL2L10mrna表达水平明显低于其配对的癌旁组织(30/42);在这30对标本中HCC组织的BCL2L10蛋白表达水平明显低于其配对的癌旁组织。2免疫组化染色显示BCL2L10在癌旁组织中高表达呈棕黄色,主要表达于细胞浆,而在HCC组织中呈现低表达。3BCL2L10mrna在癌旁组织及lo2细胞中表达较高,而在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7、smmc7721HCC细胞中表达较低,其中在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7细胞中表达降低较明显;BCL2L10蛋白在癌旁组织及lo2细胞中表达较高,而在HepG2、Huh7、smmc7721细胞中表达较低,其中在HepG2、Huh7细胞中表达降低较明显。结论:BCL2L10在HCC组织及细胞中表达较癌旁组织及正常肝细胞降低。第二部分BCL2L10对肝细胞癌增殖、凋亡作用的体内外实验研究目的:通过在体外HCC细胞中过表达或敲低BCL2L10,探讨BCL2L10对HCC增殖及凋亡的影响,在体内裸鼠成瘤试验中进一步验证其对HCC生长的作用。方法:在人HCC细胞系HepG2和Huh7中过表达BCL2L10,在人HCC细胞系smmc7721中敲低BCL2L10;通过cck-8试验检测细胞活力,克隆形成实验观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化,westernblot检测增殖标志物pcna以及细胞周期蛋白cdc25c的表达,观察BCL2L10对HCC增殖的影响;通过annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,westernblot检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)表达,评估BCL2L10对HCC凋亡的影响;裸鼠成瘤实验观察BCL2L10过表达HepG2细胞对裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果:1在HepG2和Huh7细胞系中成功过表达BCL2L10,在smmc7721中成功敲低BCL2L10。应用带flag标签的BCL2L10过表达质粒(gv141-BCL2L10)分别转染HepG2和Huh7细胞,并以仅带flag标签的空载体(gv141-control)作为对照,rt-pcr和westernblot结果显示,两种细胞BCL2L10组BCL2L10mrna和蛋白表达水平较control组均明显上升,表明该质粒在两种细胞中均成功过表达BCL2L10。应用靶向BCL2L10的sirna(si-BCL2L10)转染smmc7721细胞,并转染无关对照序列(si-control)作为对照,rt-pcr和westernblot结果显示,与si-control组比较,si-BCL2L10组BCL2L10mrna和蛋白表达水平明显下降,表明BCL2L10在smmc7721细胞中的表达被显著抑制。2BCL2L10抑制HCC细胞增殖BCL2L10抑制HCC细胞生长活力。cck-8试验结果显示,转染过表达BCL2L10质粒72h后,HepG2和Huh7两种细胞系中,BCL2L10组细胞生存率较control组明显降低。敲低BCL2L10后72hsmmc7721细胞中,敲低组smmc7721/si-BCL2L10细胞生存率较对照组smmc7721/si-control明显增高。表明BCL2L10抑制HCC细胞生长活力。BCL2L10抑制HCC细胞克隆形成。克隆形成结果显示:HepG2/control组细胞克隆数为588.0±51.05,而转染BCL2L10的HepG2/BCL2L10组细胞克隆数为230.7±35.96,明显低于阴性对照组,且形成的克隆较小。Huh7/control组细胞克隆数为386.3±24.52,而转染BCL2L10的Huh7/BCL2L10组细胞克隆数为153.0±29.57,明显低于阴性对照组,且形成的克隆较小。表明过表达BCL2L10后的HCC细胞克隆形成能力降低。BCL2L10降低HCC细胞中pcna表达。westernblot分析结果显示,过表达BCL2L10的HepG2和Huh7细胞中,BCL2L10组pcna相对表达水平明显低于control组。表明BCL2L10可抑制HCC细胞增殖。BCL2L10阻滞了细胞周期。流式细胞术结果显示,HepG2细胞在转染BCL2L10过表达质粒48h后,与对照组相比,过表达组g2/m期细胞所占比例上升,s期细胞所占比例减少,g1期细胞比例无明显变化;Huh7细胞在转染BCL2L10过表达质粒48h后,与对照组相比,过表达组g2/m期细胞所占比例上升,s期细胞所占比例减少,g1期细胞比例无明显变化。表明过表达BCL2L10可将HepG2及Huh7细胞周期阻滞在g2/m期,从而抑制细胞有丝分裂,抑制细胞增殖。BCL2L10可降低细胞分裂周期蛋白cdc25c的表达。westernblot分析结果显示,过表达BCL2L10的HepG2和Huh7两种细胞中,BCL2L10组细胞分裂周期蛋白cdc25c相对表达水平明显低于control组。表明BCL2L10可能通过抑制促分裂周期蛋白cdc25c的表达抑制细胞增殖。3BCL2L10促进HCC细胞凋亡成功将BCL2L10在HepG2和Huh7细胞上过表达、在smmc7721细胞上敲低的基础上,应用流式细胞仪annexinv/pi双染染色检测细胞凋亡比例,结果显示在HepG2和Huh7细胞过表达BCL2L10组细胞凋亡比例较对照组明显升高,在smmc7721细胞中敲低BCL2L10组细胞凋亡比例较对照组明显降低;应用westernblot检测活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)结果显示,HepG2和Huh7细胞中过表达BCL2L10组caspase-3、caspase-8及caspase-9的表达均较对照组增加。4BCL2L10抑制HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤生长裸鼠成瘤实验结果显示:BCL2L10过表达组裸鼠皮下移植瘤体积明显小于对照组。结论:BCL2L10抑制HCC增殖,促进其凋亡,抑制HCC生长。第三部分BCL2L10对肝细胞癌迁移、侵袭、血管生成作用的体内外实验研究目的:应用体内体外实验评价BCL2L10在HCC迁移、侵袭、血管生成中的作用,探讨BCL2L10在HCC转移中的作用。方法:在成功过表达以及敲低BCL2L10的基础上,应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为;应用martrigel侵袭实验评估其对HepG2细胞侵袭的影响;应用人脐静脉内皮细胞血管形成实验观察BCL2L10对HCC细胞血管形成作用的影响;对裸鼠皮下移植瘤组织行HE染色和cd34免疫组化染色,观察BCL2L10对体内移植瘤血管形成的影响;应用裸鼠HCC肺转移模型观察BCL2L10在HCC转移中的作用。结果:1BCL2L10抑制了HCC细胞迁移在HepG2、Huh7两种过表达BCL2L10细胞系中,BCL2L10组较control组划痕愈合明显减慢。在smmc7721细胞中敲低BCL2L10后si-BCL2L10组较si-control组划痕愈合速度加快。2BCL2L10明显抑制了HepG2细胞的侵袭能力。3BCL2L10抑制HCC血管生成血管形成体外实验:过表达BCL2L10组HepG2细胞的条件培养基较对照组明显减少了血管内皮细胞的血管形成能力,提示BCL2L10可抑制HCC的血管生成能力。血管形成体内实验:HE染色观察BCL2L10过表达组HepG2细胞在裸鼠体内形成的皮下移植瘤血管数量少于对照组;cd34免疫组化染色分析显示BCL2L10过表达组HepG2细胞形成的皮下移植瘤组织cd34阳性面积明显小于对照组;提示BCL2L10抑制体内HCC组织的血管生成能力。4BCL2L10抑制裸鼠HCC肺转移HE染色发现空载体HepG2细胞注射组裸鼠肺转移发生率为83.3%(5/6),而BCL2L10过表达HepG2细胞注射组裸鼠肺转移发生率为33.3%(2/6),提示BCL2L10可抑制裸鼠体内HCC肺转移。结论:BCL2L10抑制HCC迁移、侵袭、血管生成,抑制HCC肺转移。第四部分BCL2L10抑制肝细胞癌生长与转移的分子机制目的:探讨BCL2L10抑制HCC的分子机制。方法:应用BCL2L10过表达质粒转染HepG2细胞后采用人类癌症通路pcr芯片分析其基因表达谱;应用Western blot在蛋白水平验证相关基因的表达变化;结合全部四部分研究结果描绘出BCL2L10抑制HCC具体分子通路示意图。结果:1与空载体组相比,BCL2L10过表达组细胞的相关基因表达有明显变化,这些基因涉及到与肿瘤形成密切相关的细胞生长、凋亡、粘附、转移、血管生成几方面。其中,过表达BCL2L10后与对照组相比表达明显增加的基因有:与细胞凋亡相关的tnf(2.5倍)、tnfrsf25(1.8倍)和tnfrsf10b(1.5倍),与细胞粘附相关的cdh11(4.8倍)、cdh1(1.5倍),与转移抑制相关的基因timp2(20.9倍)、timp1(1.7倍);过表达BCL2L10后与对照组相比表达明显降低的基因有:与细胞迁移相关的mmp9(-8.0倍)、mmp13(-13.1倍),与血管生成相关的vegfc(-3.3倍)。过表达BCL2L10后在所有检测到有变化基因中,jak1表达变化最大,其表达较对照组下降了23倍。2Western blot结果显示:过表达BCL2L10上调了CDH11、CDH1蛋白的表达,分别下调了MMP9、VEGFC、p-LAK1 and p-STAT3蛋白的表达。3以上研究结果提示:BCL2L10可通过调节细胞周期、增殖、凋亡、转移、血管生成抑制HCC的生长与转移,在HCC发生发展中发挥其肿瘤抑制作用。结论:1过表达BCL2L10可通过上调TNF、DR3、DR5、caspase-3、caspase-8、caspase-9、CDH1、CDH11、TIMP1、TIMP2表达,下调PCNA、CDC25C、MMP9、MMP13、VEGFC表达,实现其抑制HCC生长与转移的作用。2 BCL2L10在HCC中可能通过抑制JAK1-STAT3通路激活发挥抗肿瘤作用。