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肾纤维化是各种病因导致不可逆肾损伤的共同结局,加速了向肾衰竭的转变,给家庭和社会带来了沉重的负担。然而目前对于肾纤维化的发生发展,临床上尚无有效的防治手段。因此深入研究肾纤维化病理发生的相关机制、发掘与肾纤维化密切相关的特异性靶点,有益于发展有效的防治策略。Tumor necrosis factor superfamily 14（TNFSF14）,是肿瘤坏死因子超家族成员之一,是LTβR和HVEM的共同配体。作为一种共刺激分子,TNFSF14能促进炎症反应及炎症相关疾病的发生发展。而炎症反应是组织纤维化的始动环节,持续的炎症刺激是导致肾纤维化的重要因素。因此,我们推测TNFSF14-HVEM/LTβR通路参与肾纤维化的病理过程,可能成为治疗肾纤维化的潜在靶点。鞘氨醇激酶-1（Sphingosine kinase 1,Sphk1）能催化产生1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）,与细胞的增殖、分化、迁移等多种生物学活性密切相关。在多种炎症相关的肾脏疾病中,如糖尿病肾病、多囊肾病等,Sphk1的表达显著升高。Sphk1/S1P信号通路可通过上调miR-21表达促进肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白的大量分泌和沉积;相反,Sphk1基因沉默后能显著抑制肾组织中高糖诱导的纤维蛋白沉积。表明Sphk1促进肾纤维化的发生发展。然而,TNFSF14-HVEM/LTβR通路和Sphk1的表达在肾纤维化中的相互关系目前尚不清楚。补体系统作为非特异性免疫的重要组成部分,在促进炎症反应及组织损伤中起着重要的作用。研究发现,补体C5a能直接促使肾小管上皮细胞发生EMT,而补体C5基因缺陷能显著抑制肾组织中的炎症反应及纤维化。此外,补体C5a/C5aR通路活化是Sphk1表达上调的关键因素。TNFSF14及补体通路都与免疫调节及炎症调控密切相关,大量的研究报道提示两者间似乎存在某种联系。研究目的1、研究TNFSF14及其受体HVEM/LTβR的表达与肾纤维化的相关性;2、利用Tnfsf14基因缺陷小鼠,明确TNFSF14-HVEM/LTβR通路在肾纤维化中的作用;3、探讨TNFSF14-HVEM/LTβR通路促肾纤维化的分子机制;4、研究补体C5aR信号在TNFSF14-HVEM/LTβR通路促肾纤维化中的作用。研究方法1、纤维化肾组织中TNFSF14及其受体HVEM/LTβR的表达（1）收集慢性肾病患者的穿刺肾组织样本,IHC检测纤维化肾组织中TNFSF14、HVEM和LTβR的表达;（2）收集慢性肾病患者的外周血,ELISA检测血清中sTNFSF14蛋白的水平;（3）建立单侧输尿管结扎（unilateral urethral obstruction,UUO）小鼠肾纤维化模型,收集UUO损伤后不同时间点小鼠的肾组织及外周血,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测TNFSF14及其受体HVEM/LTβR的表达变化。2、TNFSF14-HVEM/LTβR通路对肾组织纤维化病理发生的影响UUO术后第7天,收集小鼠肾组织:（1）Periodic Acid-Schiff（PAS）染色,观察Tnfsf14+/+和Tnfsf14-/-小鼠肾组织的损伤程度,并评分;（2）Sirius Red和Masson染色检测Tnfsf14+/+和Tnfsf14-/-小鼠肾组织中胶原蛋白的沉积情况;（3）通过IHC、Western Blot、IF及RT-qPCR检测Tnfsf14+/+和Tnfsf14-/-小鼠肾组织中α-SMA、E-cadherin、炎症相关因子的表达,以及局部淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况;3、TNFSF14-HVEM/LTβR促肾组织纤维化的分子机制（1）IHC检测人及小鼠纤维化肾组织中Sphk1的表达水平。连续腹腔注射PF543（Sphk1抑制剂）7天后,Masson、Sirius Red和IHC检测肾组织中胶原蛋白的沉积以及α-SMA的表达;（2）UUO术后第7天,收集Tnfsf14+/+和Tnfsf14-/-小鼠肾组织,IHC、RT-qPCR和Western Blot检测Sphk1的表达变化;（3）分离培养原代小鼠肾小管上皮细胞（mouse tubular epithelial cells,mTECs）,给予重组TNFSF14刺激后,IF检测mTECs中Sphk1的表达。4、补体C5aR信号在TNFSF14-HVEM/LTβR通路促肾纤维中的作用（1）UUO术后第7天,收集C5aR+/+和C5aR-/-小鼠肾组织,RT-qPCR和Western Blot检测纤维化相关因子以及Sphk1的表达情况,明确补体C5aR信号上调Sphk1表达及促肾纤维化作用;（2）收集慢性肾病患者的穿刺肾组织样本,IF检测C5aR和TNFSF14受体HVEM/LTβR表达定位情况;（3）UUO术后第7天,收集Tnfsf14+/+和Tnfsf14-/-小鼠肾组织和外周血,IHC、RT-qPCR检测肾组织中C5aR的表达变化;ELISA检测血清中补体活化片段C5a的含量;（4）体外实验中,给予重组TNFSF14蛋白刺激mTECs后,检测细胞中C5aR的表达;重组TNFSF14单独或联合重组C5a刺激细胞后,Western Blot检测细胞中Sphk1的表达;重组TNFSF14单独或联合C5aR拮抗剂（C5aR antagonist,C5aRA）刺激细胞后,Western Blot检测细胞中Sphk1表达变化。研究结果1、纤维化肾组织中TNFSF14及其受体HVEM/LTβR的表达明显升高（1）与正常肾组织相比,TNFSF14及其受体HVEM/LTβR在人纤维化肾组织中表达均明显升高;与健康人血清相比,慢性肾病患者血清中sTNFSF14含量明显升高;（2）与假手术组相比,UUO损伤后小鼠血清及肾组织中TNFSF14及其受体HVEM/LTβR的表达均显著上调。2、TNFSF14-HVEM/LTβR通路促进UUO诱导的肾损伤、胶原蛋白沉积以及炎症反应在UUO肾纤维模型中,与野生型小鼠相比,Tnfsf14基因缺陷后明显改善UUO诱导的肾损伤;减少肾组织中胶原沉积以及促纤维化因子α-SMA的表达;抑制肾组织中E-cadherin的降解,保护肾小管上皮细胞的完整性;显著降低肾组织中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达以及炎症细胞的浸润。3、肾纤维化中TNFSF14-HVEM/LTβR通路促进促纤维化因子Sphk1的表达（1）Sphk1在人或小鼠纤维化肾组织中表达明显升高,且Sphk1的表达水平与肾纤维化严重程度呈正相关。给予PF543抑制内源性Sphk1活性后,能显著减少UUO诱导的肾组织中胶原蛋白的沉积;（2）与野生型小鼠相比,Tnfsf14基因缺陷后能明显抑制肾组织中Sphk1的表达;（3）重组TNFSF14能直接促进mTECs中Sphk1的表达。4、TNFSF14-HVEM/LTβR通路通过活化C5aR信号介导Sphk1的表达（1）与野生型小鼠相比,C5aR基因缺陷后能显著减少UUO诱导的肾组织中促纤维化因子TGF-β1、Colla1、Vim、Fibronectin以及α-SMA的表达;（2）与野生型小鼠相比,C5aR基因缺陷后能显著抑制肾组织中Sphk1的表达;（3）IF结果显示C5aR和TNFSF14受体HVEM/LTβR在人纤维化肾组织中的表达高度共聚。与野生型小鼠相比,Tnfsf14基因缺陷后明显抑制UUO小鼠肾组织中C5aR的表达以及减少血清中补体C5a的含量;（4）体外实验发现,TNFSF14能直接促进mTECs中C5aR的表达,并且TNFSF14协同C5a上调细胞中Sphk1的表达。相反,C5aRA显著抑制TNFSF14诱导的Sphk1的表达升高。结论本研究通过体内、外实验,我们的研究首次发现:（1）TNFSF14-HVEM/LTβR通路与肾纤维化密切相关;（2）TNFSF14-HVEM/LTβR通路促进肾纤维化发生;（3）TNFSF14-HVEM/LTβR信号通过上调促纤维化因子Sphk1的表达介导肾纤维化的病理改变;（4）TNFSF14-HVEM/LTβR通路通过激活C5aR途径介导促纤维化因子Sphk1的表达,从而导致肾纤维化的发生。