论文部分内容阅读
MAGE-Al是MAGE基因家族第一个被克隆的基因，其发现原于它编码一个能被黑色素瘤病人血液中的CTL识别的肿瘤抗原。至今已鉴定出MAGE基因家族的30多个成员，这些基因表达于各种组织学类型的肿瘤，包括食道癌、非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤等，但是在男性生殖细胞除外的正常组织不表达。男性生殖细胞因不表达MHCⅠ类分子所以不能递呈抗原给CTL细胞。因MAGE编码的抗原具有严格肿瘤特异性，人们对其在肿瘤免疫治疗中的应用产生了特别的兴趣。至今己鉴定出大量MAGE-Al和MAGE基因家族其它基因的MHC Ⅰ类分子表位，一些表位肽已经进入临床试验阶段。但是现有的结果表明只有小部分接受治疗的病人表现出肿瘤消退。为了增强MAGE作为肿瘤疫苗的效应，有必要尝试对疫苗的成分作一些改进。用粒-巨噬细胞集落刺激因子、细胞因子、热休克蛋白等作为分子佐剂来增强疫苗的免疫原性是一个切实可行的方法。
细胞外HSP70是应用于肿瘤免疫治疗中的高效佐剂，它能打破对肿瘤抗原的免疫耐受，诱导肿瘤特异性的CD8<+>T细胞的杀伤效应。细胞外HSP70的免疫辅助效应是其细胞内作为应激蛋白功能的延伸。HSP70可与抗原递呈细胞表面的高亲和力受体结合，促进抗原递呈细胞成熟并促进与之结合的抗原肽递呈到细胞表面。HSP70-多肽复合物中HSP70作为信号转导的配体和抗原的载体使其能打破免疫耐受，促进肿瘤消退。HSP70-多肽复合物既能激活固有的免疫反应，又能协助抗原被MHC Ⅰ、Ⅱ类分子再次递呈，因此HSP70-多肽复合物可以诱导特异的抗肿瘤免疫反应。
为研究HSP70作为分子佐剂对MAGE-Al肿瘤疫苗的免疫增强作用，本研究先在小鼠水平研究了这一方案的可行性。本研究通过连接鼠hsp70基因和mage-al(118aa-219aa)基因片段，在原核表达载体表达出一种新的融合蛋白作为肿瘤疫苗，研究这种融合蛋白疫苗能否增强mage-al作为肿瘤疫苗的效用。
我们的结果表明hsp70和mage-al的连接能明显增强mage-al的免疫原性。免疫小鼠后，hsp70增加了mage蛋白诱导针对黑色素瘤细胞B16-mage的细胞因子分泌Th1细胞和杀伤细胞的数量，并抑制表达mage-al的B16-mage细胞在小鼠体内的生长。
本文包括两部分：一、原核表达载体的构建和蛋白纯化PCR扩增鼠hsp70基因、mage-al(118aa-219aa)基因片段和人的HSP70基因、MAGE-Al(187aa-305aa)基因片段。先亚克隆到T载体，阳性克隆经测序验证后，用限制性内切酶酶切，获得4个片段，克隆入原核表达载体pGEX4T-1。然后mage-al片段插入pGEX4T-1-m-hsp70载体构建pGEX4T-1-m-mage-hsp70融合蛋白表达载体， MAGE-Al 片段插入pGEX4T-1-h-HSP70载体构建pGEX4T-1-h-MAGE-HSP70融合蛋白表达载体。总共构建了6个表达载体：pGEX4T-1-m-mage、pGEX4T-1-m-hsp70、pGEX4T-1-m-mage-hsp70、pGEX4T-1-h-MAGE、pGEX4T-1-h-HSP70、pGEX4T-1-h-MAGE-HSP70，全部质粒经测序验证没有移码和错义突变。用GST亲和层析柱从4个表达载体(pGEX4T-1、pGEX4T-1-m-mage、pGEX4T-1-m-hsp70和pGEX4T-1-m-mage-hsp70)纯化4个蛋白(GST、mage、hsp70、mage-hsp70)，为下一步的小鼠体内免疫学实验备用。用hsp70抗体通过蛋白印迹验证了表达蛋白的hsp70成分。
二、蛋白疫苗的小鼠体内免疫学研究用PBS对照和以上纯化的4种蛋白免疫C57BL/6小鼠每周1次，2周后，分离小鼠脾淋巴细胞，用IFN-γ ELISPOT检测针对B16-mage细胞的IFN-γ分泌Thl细胞，非放射性的细胞杀伤试剂盒检测杀伤B16-mage细胞的CTL细胞。为研究疫苗对负载黑色素瘤B16-mage细胞小鼠的保护作用，小鼠接受蛋白免疫2次后，皮下接种B16-mage细胞。在研究疫苗对负载B16-mage细胞小鼠的治疗作用组，小鼠先皮下接种B16-mage细胞，2天后进行蛋白疫苗的注射。我们的结果表明GST和hsp70蛋白没有免疫原性。mage蛋白有一定的免疫原性，而且hsp70与mage连接明显增强了mage的免疫原性。小鼠经mage、mage-hsp70蛋白免疫后脾淋巴细胞中针对B16-mage的分泌IFN-γ Th1细胞和CTL细胞数量比PBS对照、GST和hsp70蛋白组多；而且mage-hsp70蛋白组比mage组多，差异有显著性。在小鼠先接受蛋白疫苗注射，后接种肿瘤细胞的方案中，mage和博士后研究工作报告mage-hsp70蛋白都可抑制肿瘤的生长，mage-*hsp70蛋白显示出更强的效用。在小鼠先接种肿瘤细胞，后接受蛋白疫苗注射的方案中，mage和mage-hsp70蛋白都没有产生抑瘤效应。综上，本研究成功构建了mage、mage-hsp70蛋白原核表达载体，并纯化蛋白进行肿瘤疫苗的临床前研究。结果表明mage、mage-hsp70蛋白都能诱导抗肿瘤免疫反应，而且hsp70和mage的融合蛋白明显增强了mage的作用。