缺血性中风是指多种因素导致的脑血管狭窄或闭塞引起的脑功能障碍,具有高发病率、高致残率及高致死率的临床发病特点,已成为危害人类健康的重大疾病之一。目前缺血性中风的治疗手段有限,主要包括溶栓和神经保护。然而溶栓因受治疗时间窗限制及出血并发症的影响导致其临床使用率较低,难以惠及大多数患者;神经保护剂虽是近年来研究的热点,对实验性中风动物模型有效,但其临床试验并未显示出良好的疗效,这就迫使我们寻找有效治疗缺血性中风的新方法。近年来,导师吴以岭院士提出指导血管病变防治的脉络学说受到广泛关注,尤其针对缺血性中风从脑“孙络—微血管”相关性研究切入,提出“缺血区微血管保护—脑梗死治疗新靶点”,既往研究初步显示通络代表药物通心络胶囊(以下简称“通心络”)对缺血性中风具有微血管介导的脑组织保护作用。因此本课题分别从理论探讨和实验研究两个方面进一步揭示脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风中的重要作用及通络干预机制。第一部分理论探讨从脉络学说探讨脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风发病中的作用及其干预策略1目的:从中医脉络学说探讨脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风发病中的作用,为脑梗死缺血区“孙络—微血管”保护新观点的提出提供理论支持;同时也为研究通心络对缺血性中风的脑微血管保护机制提供理论指导。2方法:本研究系统梳理脉络学说中有关孙络研究文献,提出脑“孙络—微血管”具有密切相关性,结合缺血性中风发病特点,探讨脑“孙络—微血管”病变在该病发病中的作用,进一步明确脑缺血区“孙络—微血管”保护的重要性;并综述了通心络对脑微血管保护的研究进展。3结果:阐明脑之孙络与脑微血管包括血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)及脑微循环在结构和功能方面具有密切相关性,论述了脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风发病中的重要作用,脑“孙络—微血管”病变导致气血渗灌、濡养代谢、津血互换障碍,脑之气络失养,同时毒邪内生,进一步损伤脑络,脑神失用,导致缺血性中风的发生,通络干预通过保护脑缺血区“孙络—微血管”,进而发挥脑组织保护作用,为“缺血区微血管保护—脑梗死治疗新靶点”提供理论支持,文献研究初步显示通心络对缺血性中风具有脑微血管保护作用。4小结:脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风发病中起重要作用,明确缺血性中风脑“孙络—微血管”保护的必要性,通络干预通过保护脑缺血区“孙络—微血管”,进而发挥脑组织保护作用,为脑梗死缺血区“孙络—微血管”保护观点进一步提供理论支持;同时也为从实验角度探讨通心络对缺血性中风的脑微血管保护机制提供理论指导。第二部分实验研究通心络对缺血性中风小鼠脑微血管保护作用及其机制研究第一章缺血性中风动物模型的建立及评价1方法:(1)选用C57BL/6J小鼠为研究对象,采用线栓法建立缺血性中风动物模型—永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO),将造模后(pMCAO)及假手术(Sham)小鼠分别分为2个时间点(6h和24h)亚组。(2)应用改良的神经功能缺损评分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)评价 pMCAO 小鼠神经功能,采用脑TTC染色检测是否出现脑梗死。2结果:(1)神经功能:造模后6h和24hSham组小鼠活动自如,无神经功能缺损表现,而模型组则出现明显的神经功能缺损,表现为偏侧运动、感觉及反射功能障碍。(2)脑TTC染色:造模后6h和24hSham组小鼠TTC染色均显示红色,表明未出现脑组织梗死;而模型组在6h和24h缺血侧均有白色显示,说明模型组小鼠发生脑梗死,表明造模成功;而且模型24 h亚组脑梗死面积明显大于6 h亚组,表明24 h亚组脑缺血程度较重。3小结:通过线栓法建立的pMCAO小鼠出现了神经功能缺损表现及脑组织梗死,是可靠、稳定的模型,该模型易于复制、成功率高,为后续研究打下坚实的基础。第二章通心络对缺血性中风小鼠的脑保护作用1方法:(1)选用C57BL/6J小鼠,采用线栓法建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组、阳性对照药恩必普组(NBP)、通心络高剂量组(TXL-H)、通心络中剂量组(TXL-M)、通心络低剂量组(TXL-L),药物干预组在造模后1h、3h、21h分别给予通心络(TXL-H,3.0g/kg;TXL-M,1.5g/kg;TXL-L,0.75g/kg)及恩必普(123 mg/kg)灌胃给药,Sham及pMCAO组在相应时间点给予相同体积的溶媒(1%Tween 80)。(2)分别在造模后6h和24h采用mNSS进行神经功能评分,并应用脑TTC染色测量脑梗死相对体积、干湿重法检测脑水含量评估脑水肿。2结果:(1)神经功能:Sham组小鼠活动正常,未出现神经功能缺损表现,而其它组小鼠均出现了神经功能缺损表现;与pMCAO组相比,TXL各剂量及NBP在造模后6 h和24 h均改善了 pMCAO小鼠神经功能(P<0.01),TXL-H、TXL-M及NBP改善神经功能优于TXL-L(P<0.05),而TXL-H、TXL-M及NBP在改善神经功能方面相比无统计学差异(P>0.05),提示TXL-H及TXL-M在改善神经功能方面与NBP相当。(2)脑梗死体积:在造模后6 h,与pMCAO组相比,TXL-H及NBP均明显缩小了 pMCAO小鼠脑梗死体积(P<0.05或P<0.01),且TXL-H在缩小脑梗死体积方面与NBP相当(P>0.05);而TXL-M和TXL-L组脑梗死体积与pMCAO组相比均无统计学差异(P>0.05)。在造模后24 h,与pMCAO组相比,TXL各剂量及NBP均明显降低了脑梗死体积(P<0.05或P<0.01),TXL-H在降低脑梗死体积方面显著优于TXL-L(P<0.01),与NBP及TXL-M相比无统计学差异(P>0.05)。(3)脑水含量:pMCAO组脑水含量在造模后6h及24 h均明显高于Sham组(P<0.05),提示在造模后6 h及24 h小鼠均出现脑水肿,且在24 h脑水肿更明显;而各药物干预组在造模后6 h及24 h脑水含量与pMCAO组相比无统计学差异(P>0.05),提示TXL各剂量及NBP均未能减轻pMCAO小鼠脑水肿。3小结:通心络能缩小缺血性中风小鼠脑梗死体积,改善神经功能缺损,显示了良好的脑保护作用。第三章通心络对缺血性中风小鼠的脑微血管保护作用及其机制研究第一节通心络对缺血性中风小鼠的脑微血管保护作用1方法:(1)建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组、NBP组、TXL-H组、TXL-M组及TXL-L组,在造模后1 h、3 h和21 h分别给予相应药物干预组通心络(TXL-H,3.0g/kg;TXL-M,1.5g/kg;TXL-L,0.75g/kg)及恩必普(123mg/kg)灌胃给药,Sham及pMCAO组在相应时间点给予相同体积的溶媒(1%Tween 80)。(2)分别在造模后6h和24h采用免疫荧光法检测脑缺血区微血管结构,并用伊文思蓝(Evans blue,EB)检测脑缺血区BBB通透性。2结果:(1)脑微血管结构:Sham组血管壁光滑、完整,而pMCAO组血管壁不规则、不连续,部分管壁明显缺如,药物干预组血管壁损伤情况介于pMCAO组和Sham组之间,其中TXL-H组微血管损伤最轻,其次是TXL-M组及NBP组,提示TXL及NBP均能够保护脑缺血区微血管结构,其中TXL-H优于NBP。(2)EB检测BBB通透性结果:①EB荧光法测定结果:Sham组及其他组缺血对侧微血管完好,红色荧光染料EB局限于血管内,无渗漏,而pMCAO组及各药物干预组缺血侧在造模后6h和24h均有不同程度的荧光染料血管渗漏,以时间点来看在24 h血管渗漏更严重,以组间差别来看pMCAO组渗漏最严重,其次是TXL-L组,NBP及TXL-M组染料渗漏相对较轻,TXL-H组最轻。②脑组织EB浓度测定结果:缺血后6h和24h,NBP组、TXL-H组及TXL-M组EB含量明显低于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),而TXL-L组EB含量与pMCAO组相比无显著性差异(P>0.05);在缺血后6h,TXL-H组及TXL-M组EB含量明显低于TXL-L组(P<0.05);在缺血后24h,TXL-H组EB含量明显低于NBP组、TXL-M组及TXL-L 组(P<0.05 或 P<0.01),提示 TXL-H、TXL-M 及 NBP 均能保护 pMCAO 小鼠 BBB,且TXL-H效果优于NBP及TXL-M。3小结:通心络能保护缺血性中风小鼠脑微血管结构,降低BBB通透性,初步证实了通心络对缺血性中风小鼠的脑微血管保护作用。第二节通心络对缺血性中风小鼠的脑微血管保护作用机制研究实验一 Sonic hedgehog信号通路介导的通心络对缺血性中风小鼠BBB保护研究1方法:(1)建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组、TXL组、阻断剂环巴胺组(cyclopamine,CP)及TXL+CP组;在造模后1 h、3 h和21 h分别给予TXL组及TXL+CP组小鼠通心络(3.0g/kg)灌胃,其他组给予相应体积的生理盐水灌胃,同时给予CP组及TXL+CP组腹腔注射CP(10 mg/kg),其他组腹腔注射等量的生理盐水。(2)在造模后6h和24 h应用EB检测脑缺血区BBB通透性,采用免疫荧光法定位脑缺血区Shh的细胞来源并定性其表达量,同时应用Western blot检测脑缺血区紧密连接蛋白(Occludin,Claudin-5,ZO-1)及 Shh 信号通路(Shh,Patched,Smo,Gli-1)蛋白表达。2结果:(1)EB荧光法检测BBB通透性结果:缺血后6 h和24h,TXL组渗漏到血管外的EB荧光强度和面积均明显小于pMCAO组(P<0.01),提示通心络对pMCAO小鼠BBB具有保护作用;而TXL+CP组及CP组渗漏到血管外的EB荧光强度和面积均明显大于TXL组(P<0.05或P<0.01),表明Shh阻断剂环巴胺反转了通心络对BBB的保护作用。(2)Western blot检测紧密连接蛋白结果:脑缺血后6h和24h,pMCAO组Occludin、Claudin-5及ZO-1表达明显低于Sham组(P<0.01),表明造模后缺血区脑皮质紧密连接破坏;而TXL组的紧密连接蛋白表达明显高于pMCAO组(P<0.01),提示通心络上调了缺血区脑皮质Occludin、Claudin-5及ZO-1的表达;而TXL+CP组及CP组紧密连接蛋白表达均低于TXL组(P<0.05或P<0.01),表明环巴胺阻断了通心络对脑缺血后Occludin、Claudin-5及ZO-1的上调作用。(3)Shh免疫荧光与Western blot检测结果:黄色荧光(Shh)与绿色荧光(GFAP)部分重叠,提示Shh与GFAP共定位于星形胶质细胞,部分黄色荧光围绕在红色荧光(EB)周围,提示Shh可能存在于内皮细胞,结合既往Shh研究,初步证明本实验Shh由星形胶质细胞分泌,并可作用于血管内皮细胞;脑缺血后6h和24h,pMCAO组Shh表达明显低于Sham组(P<0.01),提示脑缺血后Shh表达下调;而TXL组Shh表达明显高于pMCAO组及CP组(P<0.05或P<0.01),提示通心络上调了脑缺血区Shh表达;TXL组Shh表达与TXL+CP组相比无统计学差异(P>0.05),表明Shh阻断剂环巴胺不干预Shh表达。(4)Shh信号分子(Patched,Smo,Gli-1)Western blot 检测结果:脑缺血后 6 h 和 24 h,TXL 组 Patched、Smo、Gli-1表达明显高于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),表明通心络激活了脑缺血区Shh信号通路;而TXL+CP组及CP组Patched、Smo、Gli-1表达明显低于TXL组(P<0.05或P<0.01),TXL+CP组Gli-1表达在脑缺血后6h与TXL组相比无统计学差异(P>0.05),提示Shh信号通路阻断剂环巴胺阻断了 TXL对Shh信号通路的激活。3小结:Shh信号通路介导通心络对缺血性中风小鼠紧密连接蛋白表达的上调作用,从而保护 BBB。实验二LRP-1介导的通心络对缺血性中风小鼠BBB的影响1方法:(1)建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组、TXL组、阻断剂RAP(receptor-associated protein)组及 TXL+RAP 组;在造模后 1 h、3 h 和 21 h 分别给予TXL组及TXL+RAP组通心络(3.0g/kg)灌胃,其他组给予等量的生理盐水灌胃,同时给予RAP组及TXL+RAP组侧脑室注射5μLRAP(9μM),其他组侧脑室注射等量的无菌PBS。(2)分别在造模后6 h和24 h应用EB检测各组小鼠BBB通透性,采用免疫荧光检测脑缺血区LRP-1表达,同时应用Western blot检测脑缺血区紧密连接蛋白(Occludin,Claudin-5,ZO-1)及 LRP-1 表达。2结果:(1)EB荧光法检测BBB通透性结果:TXL组、RAP组及TXL+RAP组渗漏到血管外的EB荧光强度和面积均明显小于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),表明TXL及RAP对脑缺血后的BBB均具有保护作用;而TXL+RAP组渗漏到血管外的EB荧光强度和面积与TXL组比较无统计学差异(P>0.05),表明TXL对脑缺血后的BBB保护作用并未被RAP加强。(2)Western blot检测紧密连接蛋白结果:TXL组、RAP组及TXL+RAP组缺血脑皮质Occludin、Claudin-5及ZO-1的表达均明显高于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),提示TXL与RAP均上调了缺血脑皮质Occludin、Claudin-5及ZO-1的表达。(3)LRP-1免疫荧光及Western blot结果:脑缺血后6 h和24 h,pMCAO组LRP-1表达明显高于Sham组(P<0.01),表明脑缺血后LRP-1表达上调;而TXL组、RAP组及 TXL+RAP 组 LRP-1 表达均低于 pMCAO 组(P<0.05 或 P<0.01),表明 TXL 与 RAP均下调了 LRP-1表达。Western blot结果显示,脑缺血后6 h,LRP-1表达TXL组、RAP组及TXL+RAP组相比无统计学差异(P>0.05);而脑缺血后24 h,TXL+RAP组与RAP组LRP-1表达均低于TXL组(P<0.01),表明RAP增强了 TXL对LRP-1的下调作用。3小结:通心络通过抑制LRP-1进而上调缺血性中风小鼠紧密连接蛋白表达,从而保护BBB。第四章通心络对缺血性中风小鼠脑微循环障碍的影响及其机制研究第一节通心络对缺血性中风小鼠脑微循环障碍的影响1方法:(1)建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组、NBP组、TXL-H组、TXL-M组及TXL-L组,在造模后1 h、3 h和21 h分别给予相应药物干预组通心络(TXL-H,3.0g/kg;TXL-M,1.5g/kg;TXL-L,0.75g/kg)及恩必普(123mg/kg)灌胃给药,Sham及pMCAO组在相应时间点给予相应体积的溶媒(1%Tween 80)。(2)于造模后6 h和24 h用双光子显微镜观察各组小鼠脑微循环,测量其梗死周围区微血管管径、血流速度及血流量等指标;观察正常区、梗死中心区及梗死周围区微小静脉内白细胞的黏附、聚集和滚动,并计算梗死周围区单位血管壁面积上白细胞黏附数。2结果:(1)脑梗死周围区毛细血管血流速度和血流量:脑缺血后6 h和24 h,pMCAO组血流速度及血流量明显小于Sham组(P<0.01),提示脑缺血后存在微循环障碍。在缺血后6 h,TXL各剂量组及NBP组血流速度及血流量明显大于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),说明TXL及NBP干预后脑微循环障碍均有不同程度的改善;TXL-H组血流速度及血流量明显大于TXL-L组(P<0.05),与TXL-M组及NBP组相比无统计学意义(P>0.05)。在脑缺血后24 h,与pMCAO组相比,仅TXL-H及NBP增加脑缺血区血流速度及血流量(P<0.01),而TXL-M与TXL-L未增加(P>0.05);TXL-H组血流速度及血流量明显大于TXL-M组(P<0.05)和TXL-L组(P<0.01),与NBP组相比无统计学差异(P>0.05),这些说明TXL-H在改善脑缺血微循环方面优于TXL-M及TXL-L,与NBP效果相当。(2)在缺血后6 h,TXL各剂量组及NBP组黏附在单位面积微静脉管壁上的白细胞数明显少于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),TXL-H组、TXL-M组及NBP组白细胞数明显少于TXL-L组(P<0.05或P<0.01),提示TXL与NBP均能降低脑缺血后白细胞聚集、黏附,进而抑制炎症反应,且TXL-H、TXL-M抑制作用强于TXL-L;在缺血后24 h,TXL-H组及NBP组黏附在单位面积微静脉管壁上的白细胞数明显少于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),而TXL-M组及TXL-L组与pMCAO组相比无显著性差异(P>0.05),提示在这个时间点仅TXL-H及NBP降低了脑缺血后的白细胞聚集、黏附。3小结:通心络能改善脑缺血小鼠微循环障碍,其机制与抑制白细胞—内皮相互作用有关。第二节通心络对缺血性中风小鼠血管活性物质及黏附分子表达的影响1方法:(1)建立pMCAO小鼠模型,随机分为Sham组、pMCAO组及TXL组,TXL组在造模后lh、3h及21h分别给予TXL(3.0g/kg)灌胃给药,Sham及pMCAO组在相应时间点给予等量的生理盐水。(2)在造模后6 h和24 h采用ELISA法检测小鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2及ET-1水平,应用Western blot检测脑缺血区皮层黏附分子(ICAM-1,VACM-1,P-selectin,E-selectin)表达。2结果:(1)血管活性物质:①血清6-keto-PGF1α水平:缺血后6 h,TXL组、pMCAO组及Sham组相比无统计学差异(P>0.05);而缺血后24h,pMCAO组与Sham组相比明显升高(P<0.01),提示脑缺血后血清中PGI2(稳定的代谢产物为6-keto-PGF1α)代偿性升高,而TXL降低了 PGI2水平(P<0.05)。②血清TXB2水平:脑缺血后6h和24h,TXL组、pMCAO组及Sham组三组相比无统计学差异(P>0.05)。③血清6-keto-PGF1α与TXB2比值:缺血后6h和24h,pMCAO组6-keto-PGF1α/TXB2比值明显大于Sham组(P<0.01),而 TXL 降低了 6-keto-PGF1α/TXB2 比值(P<0.05)。④血清 ET-1 水平:缺血后6h和24 h,pMCAO组ET-1水平与Sham组相比明显降低(P<0.01),提示脑缺血后ET-1降低;缺血后6h,与pMCAO组相比,TXL升高了 ET-1(P<0.05),而在缺血后24h,TXL组与pMCAO组相比ET-1水平无统计学差异(P>0.05)。(2)黏附分子表达:脑缺血后6 h和24 h,pMCAO组ICAM-1表达与Sham组相比显著上调(P<0.01),提示脑缺血后梗死周围区皮层ICAM-1上调;而通心络治疗组明显低于pMCAO组(P<0.05或P<0.01),表明通心络下调了 pMCAO小鼠脑梗死周围区皮层ICAM-1表达。脑缺血后24 h,pMCAO组P-selectin表达与Sham组相比显著上调(P<0.01),提示脑缺血后梗死周围区皮层P-selectin上调;而通心络治疗组明显低于pMCAO组(P<0.01),表明通心络下调了 pMCAO小鼠脑梗死周围区皮层P-selectin表达;而脑缺血后6h三组相比无统计学差异(P>0.05)。脑缺血后6h和24h,VCAM-1、E-selectin表达三组相比无统计学差异(P>0.05)。3小结:通心络改善缺血性中风小鼠脑微循环障碍,其机制与调节血清中血管活性物质(6-keto-PGF1α、6-keto-PGF1α与TXB2比值、ET-1)表达,抑制脑缺血区黏附分子ICAM-1及P-selectin表达相关。结论:1理论研究:本研究以脉络学说为指导,从“孙络—微血管”相关性切入,阐明脑之孙络与BBB及脑微循环的密切关系,揭示缺血性中风脑“孙络—微血管”病变导致气血渗灌、濡养代谢、津血互换障碍,进而引起脑之气络失养,毒损脑络,脑神失用,明确脑“孙络—微血管”病变在缺血性中风发病中的关键致病作用。通络干预可以通过保护缺血区“孙络—微血管”,进而发挥脑组织保护作用,从而为脑梗死缺血区“孙络—微血管”保护观点进一步提供理论支持;同时也为从实验角度探讨通心络对缺血性中风的脑微血管保护机制提供理论指导。2实验研究:研究证实通心络对缺血性中风微血管介导的脑保护作用;进一步研究发现了通心络对缺血性中风的脑微血管保护机制:激活Shh信号通路和抑制LRP-1表达,进而上调紧密连接蛋白,从而保护BBB;同时,用双光子显微镜证实通心络能改善缺血性中风脑微循环障碍,其机制与调节血管活性物质(6-keto-PGF1α、6-keto-PGF1α与TXB2比值、ET-1)表达,抑制黏附分子ICAM-1及P-selectin表达相关。