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实验目的:癌症是世界严重的公共卫生问题,据国际癌症研究机构公布的数据显示,每年全球约800万人死于癌症。在我国每6分钟就有一人被确诊为癌症,每天有8550人成为癌症患者。因此,深入认识癌症并寻找诊断治疗癌症的靶标刻不容缓。生物体的生存离不开能量的供应,肿瘤细胞也不例外。恶性肿瘤在有氧环境下仍然保持异常旺盛的糖酵解(Warburg效应),这种代谢的转变是为了满足肿瘤增殖活力和生物合成的需求,其中一个起重要作用的关键酶便是丙酮酸激酶,其与多种肿瘤的分期分型、恶性程度等密切相关。但在肿瘤发生早期,Pkm2是如何发挥作用的,其复杂的表达调控是如何建立的尚不清楚。这是由于肿瘤发生的过程不能够被人们捕捉的原因。随着对肿瘤各方面性质的深入研究,人们发现肿瘤与干细胞存在密切联系,如Wnt、Notch、SHH等信号通路的相似性,ES特异基因Oct4、Sox2、Nanog等在肿瘤中同样高表达等。因此,我们拟把重编程过程作为模拟肿瘤发生的体外研究平台,研究Pkm2在重编程过程中的表达模式及功能,探讨其对重编程过程的影响和调控,为揭示Pkm2在肿瘤发生中的表达调控并发现新的潜在诊疗靶标提供理论基础。实验方法:首先,我们利用构建成功的二次重编程系统小鼠制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)。然后利用MEF细胞在含有强力霉素(Dox)的ES培养基中诱导重编程,成功得到诱导多功能干细胞(iPS cell)。随后,利用shRNA将Pkm敲低后进行诱导,观察克隆生成情况。为了检测重编程过程中Pk基因的表达变化,我们在诱导过程中在不同的时间点取样,用qPCR和Western Blot分别检测Pkm1,pkm2的表达情况,对它们的表达变化进行分析。最后,通过qPCR检测Pkm2的相关调控基因的表达。根据已知的Pkm2基因在肿瘤细胞中的调控情况,探寻在肿瘤细胞中相关调控基因Ptb,hnRANPA1,hnRNPA2B1,Hif-1α等在重编程过程中的表达趋势。然后对它们进行上调或者敲低表达后,观察其对重编程过程的影响及对Pkm2、Pkm1基因的调控作用。Pk基因的几种亚型中,只有Pkm2能够被变构调节:低激酶活性的二聚体形式和高激酶活性的四聚体形式。在肿瘤细胞中高表达Pkm2二聚体形式,而高激酶活性的Pkm2四聚体形式表达较低。我们将利用Western Blot检测在重编程过程中Pkm2两种变构形式的变化关系。实验结果:1、Pkm2在重编程过程中起到重要作用,不可或缺;2、Pkm2在多能细胞中入核或可作为转录因子参与基因调控;3、Pkm2在重编程过程中与其在肿瘤细胞已知的相关特征相一致,可以通过对重编程过程的研究构建其调控网络,进一步探索新的可能的调控因子。