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【研究背景】
冠心病(CHD)是由于冠状动脉粥样硬化形成斑块引起血管狭窄导致心肌缺血而引发的疾病。目前许多治疗手段如药物溶栓、介入支架手术、外科冠脉搭桥都能够有效开通血管，减少病死率。但是由于血运的恢复，再灌注损伤所造成的心功能障碍以及生存质量的下降依然是严峻的问题。因此，如何有效减少心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤是临床治疗面临的重大课题。
研究证实，κ阿片受体(κ-OR)为心血管系统中阿片受体的主要亚型，在心血管系统中具有重要的调控作用。我们前期研究发现，激活κ-OR能够有效地抑制MI/R损伤导致的心律失常，减少心肌细胞凋亡，降低心梗面积，有效防治心肌细胞坏死。同时在MI/R模型中，激活κ-OR能够激活血红素加氧酶1(HO-1)减少氧化应激，有效治疗心力衰竭，改善心功能。上述结果表明，κ阿片受体介导了明确的心肌保护作用。
线粒体是细胞存活的关键调节器，MI/R中线粒体功能障碍会导致能量代谢平衡紊乱，致使线粒体形态异常，造成心肌细胞损伤，诱发细胞凋亡，甚至导致细胞坏死。因此，有效保护线粒体的结构和功能可能是保护缺血心肌的重要途径。但κ-OR激活是否能够通过保护线粒体的功能进而实现对缺血心肌的保护作用尚未见报道，我室前期的研究中早已发现κ-OR激活具有保护缺血心肌线粒体超微结构的作用，但其对缺血心肌线粒体功能的调节作用及具体机制尚不清楚。
AMPK的激活对MI/R损伤具有心脏保护效应。我们前期的研究表明，内源性以及外源性兴奋κ-OR能够激活AMPK信号通路实现心肌保护作用。而作为AMPK的下游分子GSK-3β的磷酸化对于MI/R损伤的心脏具有保护作用。但是κ-OR激活是否通过AMPK/GSK-3β信号通路进而调节线粒体的功能并实现对缺血心肌的保护作用尚不清楚。在弄清这个问题之前首先要明确κ-OR激活对心肌线粒体功能的调节作用。
因此，本研究拟探讨外源性κ-OR激动剂U50,488H对缺血心肌线粒体的调节作用及可能机制。
【研究目的】
1．整体水平探讨κ-OR激动剂通过AMPK信号通路对大鼠MI/R损伤的线粒体保护作用及其机制。
2．细胞水平探讨κ-OR激动剂通过AMPK信号通路对H9c2心肌细胞模拟I/R损伤的线粒体保护作用及其机制。
【研究方法】
1．所有SD雄性大鼠随机分为6组：假手术(Sham)组；假手术+U50,488H(Sham+U50)组；MI/R损伤(MI/R)组；MI/R损伤+U50,488H(MI/R+U50)组；MI/R损伤+U50,488H+nor-BNI(κ-OR阻断剂)(MI/R+U50+nor-BNI)组；MI/R损伤+U50,488H+CompoundC(AMPK阻断剂)(MI/R+U50+CompoundC)组。应用冠状动脉前降支(LAD)结扎30min，松开结扎线120min予以再灌注行MI/R损伤造模，测定心肌损伤标志物水平、心梗面积、心肌细胞凋亡程度以及凋亡蛋白的表达。
2．大鼠心肌细胞线粒体功能的检测：分别用试剂盒检测心肌细胞ATP合成水平、线粒体呼吸链复合物表达水平、线粒体膜通透性转换孔的开放情况，以及用Westernblotting(WB)分别测定胞浆和线粒体中CytochromeC表达水平。
3．大鼠心肌细胞线粒体形态的检测：透射电镜检测心肌细胞线粒体结构状态。
4．WB测定大鼠心肌细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平；同时测定线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达水平。
5．应用H9c2细胞模拟I/R损伤，将其随机分为6组：对照(Control)组；对照+U50,488H(Control+U50)组；缺氧/复氧(H/R)组；H/R+U50,488H(H/R+U50)组；H/R+U50,488H+nor-BNI(H/R+U50+nor-BNI)组；H/R+U50,488H+CompoundC(H/R+U50+CompoundC)组。应用98%N2和2%CO2缺氧条件进行模拟I/R损伤造模，应用CCK8检测细胞活力，LDH释放试剂盒检测细胞LDH漏出率，并摸索出适宜的U50,488H药物浓度。检测细胞凋亡水平以及凋亡蛋白的表达。
6．检测H9c2细胞线粒体功能：用试剂盒检测线粒体膜电位水平、线粒体膜通透性转换孔的开放情况，以及用WB分别测定胞浆和线粒体中CytochromeC表达水平。
7．检测H9c2细胞线粒体形态：激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体形态。
8．WB测定H9c2细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平；同时测定线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达水平。
9．H9c2细胞随机分为4组：H/R+ScramblesiRNA+Vehicle组；H/R+ScramblesiRNA+U50组；H/R+AMPKαsiRNA+Vehicle组；H/R+AMPKαsiRNA+U50组。细胞被siRNA转染后进行H/R造模，复氧开始同时进行给药。用激光共聚焦显微镜观察线粒体膜通透性转换孔的开放情况、以及细胞线粒体形态。
10．WB测定siRNA转染后H9c2细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平。
【研究结果】
第一部分：κ-OR激动剂对大鼠MI/R心肌线粒体的保护作用
1．在MI/R模型中，U50,488H显著减少MI/R损伤导致的心肌梗死面积，并且通过激活AMPK抑制了MI/R损伤诱导的血清TnT和LDH水平；U50,488H通过激活AMPK发挥了抗凋亡作用。
2．在MI/R模型中，U50,488H通过激活AMPK缓解了线粒体结构损伤；U50,488H通过激活AMPK提高了MI/R的Mito-mPTP的活性，减少其开放，抑制了小分子CytochromeC由线粒体向胞浆的释放，由此改善了线粒体的功能；U50,488H通过激活AMPK增加了ATP产量以及线粒体呼吸链复合物活性，改善了线粒体的能量代谢并且增加了线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达。
3．在MI/R模型中，U50,488H通过激活κ-OR增加了AMPKα和GSK-3β的磷酸化水平。
第二部分：κ-OR激动剂对H9c2心肌细胞模拟I/R损伤线粒体的保护作用
1．在H/R状态下，U50,488H通过激活AMPK增加了H9c2心肌细胞活力、减少了心肌细胞LDH的释放而减少细胞损伤，其中50μMU50,488H比其它浓度有更明显的效果。U50,488H通过激活AMPK发挥了抗心肌细胞凋亡作用，减少凋亡蛋白的表达。
2．在H/R状态下，U50,488H通过激活AMPK缓解了H/R心肌细胞的线粒体结构损伤，降低了H/R心肌细胞Mito-mPTP开放，减少了线粒体中CytochromeC的释放，使H/R心肌细胞的MMP趋于稳定，同时增加了线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达。
3．在H/R状态下，U50,488H通过激活κ-OR增加AMPKα和GSK-3β的磷酸化。
第三部分：AMPKα沉默对κ-OR激动剂保护模拟I/R心肌细胞线粒体的影响
1．U50,488H通过激活AMPK缓解H/R心肌细胞的线粒体结构损伤、减少H/R心肌细胞的Mito-mPTP开放以改善线粒体功能障碍，此作用能够被AMPKαsiRNA予以消除。
2．U50,488H通过激活κ-OR增加AMPKα和GSK-3β的磷酸化，这种效应能够被AMPKαsiRNA予以消除。
【研究结论】
1．κ-OR激动剂U50,488H对缺血再灌注心肌的线粒体的结构和功能具有显著的保护作用，具体表现为改善线粒体的结构、增加ATP产量、稳定线粒体膜电位、降低Mito-mPTP开放、减少CytochromeC的释放以及增加了线粒体的生物合成等。
2．κ-OR激动剂U50,488H保护线粒体的作用机制可能与κ-OR介导的AMPK依赖的信号通路有关。至于AMPK的下游信号以及线粒体保护与心肌保护之间的关系等都有待于进一步研究确定。
冠心病(CHD)是由于冠状动脉粥样硬化形成斑块引起血管狭窄导致心肌缺血而引发的疾病。目前许多治疗手段如药物溶栓、介入支架手术、外科冠脉搭桥都能够有效开通血管，减少病死率。但是由于血运的恢复，再灌注损伤所造成的心功能障碍以及生存质量的下降依然是严峻的问题。因此，如何有效减少心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤是临床治疗面临的重大课题。
研究证实，κ阿片受体(κ-OR)为心血管系统中阿片受体的主要亚型，在心血管系统中具有重要的调控作用。我们前期研究发现，激活κ-OR能够有效地抑制MI/R损伤导致的心律失常，减少心肌细胞凋亡，降低心梗面积，有效防治心肌细胞坏死。同时在MI/R模型中，激活κ-OR能够激活血红素加氧酶1(HO-1)减少氧化应激，有效治疗心力衰竭，改善心功能。上述结果表明，κ阿片受体介导了明确的心肌保护作用。
线粒体是细胞存活的关键调节器，MI/R中线粒体功能障碍会导致能量代谢平衡紊乱，致使线粒体形态异常，造成心肌细胞损伤，诱发细胞凋亡，甚至导致细胞坏死。因此，有效保护线粒体的结构和功能可能是保护缺血心肌的重要途径。但κ-OR激活是否能够通过保护线粒体的功能进而实现对缺血心肌的保护作用尚未见报道，我室前期的研究中早已发现κ-OR激活具有保护缺血心肌线粒体超微结构的作用，但其对缺血心肌线粒体功能的调节作用及具体机制尚不清楚。
AMPK的激活对MI/R损伤具有心脏保护效应。我们前期的研究表明，内源性以及外源性兴奋κ-OR能够激活AMPK信号通路实现心肌保护作用。而作为AMPK的下游分子GSK-3β的磷酸化对于MI/R损伤的心脏具有保护作用。但是κ-OR激活是否通过AMPK/GSK-3β信号通路进而调节线粒体的功能并实现对缺血心肌的保护作用尚不清楚。在弄清这个问题之前首先要明确κ-OR激活对心肌线粒体功能的调节作用。
因此，本研究拟探讨外源性κ-OR激动剂U50,488H对缺血心肌线粒体的调节作用及可能机制。
【研究目的】
1．整体水平探讨κ-OR激动剂通过AMPK信号通路对大鼠MI/R损伤的线粒体保护作用及其机制。
2．细胞水平探讨κ-OR激动剂通过AMPK信号通路对H9c2心肌细胞模拟I/R损伤的线粒体保护作用及其机制。
【研究方法】
1．所有SD雄性大鼠随机分为6组：假手术(Sham)组；假手术+U50,488H(Sham+U50)组；MI/R损伤(MI/R)组；MI/R损伤+U50,488H(MI/R+U50)组；MI/R损伤+U50,488H+nor-BNI(κ-OR阻断剂)(MI/R+U50+nor-BNI)组；MI/R损伤+U50,488H+CompoundC(AMPK阻断剂)(MI/R+U50+CompoundC)组。应用冠状动脉前降支(LAD)结扎30min，松开结扎线120min予以再灌注行MI/R损伤造模，测定心肌损伤标志物水平、心梗面积、心肌细胞凋亡程度以及凋亡蛋白的表达。
2．大鼠心肌细胞线粒体功能的检测：分别用试剂盒检测心肌细胞ATP合成水平、线粒体呼吸链复合物表达水平、线粒体膜通透性转换孔的开放情况，以及用Westernblotting(WB)分别测定胞浆和线粒体中CytochromeC表达水平。
3．大鼠心肌细胞线粒体形态的检测：透射电镜检测心肌细胞线粒体结构状态。
4．WB测定大鼠心肌细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平；同时测定线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达水平。
5．应用H9c2细胞模拟I/R损伤，将其随机分为6组：对照(Control)组；对照+U50,488H(Control+U50)组；缺氧/复氧(H/R)组；H/R+U50,488H(H/R+U50)组；H/R+U50,488H+nor-BNI(H/R+U50+nor-BNI)组；H/R+U50,488H+CompoundC(H/R+U50+CompoundC)组。应用98%N2和2%CO2缺氧条件进行模拟I/R损伤造模，应用CCK8检测细胞活力，LDH释放试剂盒检测细胞LDH漏出率，并摸索出适宜的U50,488H药物浓度。检测细胞凋亡水平以及凋亡蛋白的表达。
6．检测H9c2细胞线粒体功能：用试剂盒检测线粒体膜电位水平、线粒体膜通透性转换孔的开放情况，以及用WB分别测定胞浆和线粒体中CytochromeC表达水平。
7．检测H9c2细胞线粒体形态：激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体形态。
8．WB测定H9c2细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平；同时测定线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达水平。
9．H9c2细胞随机分为4组：H/R+ScramblesiRNA+Vehicle组；H/R+ScramblesiRNA+U50组；H/R+AMPKαsiRNA+Vehicle组；H/R+AMPKαsiRNA+U50组。细胞被siRNA转染后进行H/R造模，复氧开始同时进行给药。用激光共聚焦显微镜观察线粒体膜通透性转换孔的开放情况、以及细胞线粒体形态。
10．WB测定siRNA转染后H9c2细胞pAMPKα、AMPKα及pGSK-3β、GSK-3β的表达水平。
【研究结果】
第一部分：κ-OR激动剂对大鼠MI/R心肌线粒体的保护作用
1．在MI/R模型中，U50,488H显著减少MI/R损伤导致的心肌梗死面积，并且通过激活AMPK抑制了MI/R损伤诱导的血清TnT和LDH水平；U50,488H通过激活AMPK发挥了抗凋亡作用。
2．在MI/R模型中，U50,488H通过激活AMPK缓解了线粒体结构损伤；U50,488H通过激活AMPK提高了MI/R的Mito-mPTP的活性，减少其开放，抑制了小分子CytochromeC由线粒体向胞浆的释放，由此改善了线粒体的功能；U50,488H通过激活AMPK增加了ATP产量以及线粒体呼吸链复合物活性，改善了线粒体的能量代谢并且增加了线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达。
3．在MI/R模型中，U50,488H通过激活κ-OR增加了AMPKα和GSK-3β的磷酸化水平。
第二部分：κ-OR激动剂对H9c2心肌细胞模拟I/R损伤线粒体的保护作用
1．在H/R状态下，U50,488H通过激活AMPK增加了H9c2心肌细胞活力、减少了心肌细胞LDH的释放而减少细胞损伤，其中50μMU50,488H比其它浓度有更明显的效果。U50,488H通过激活AMPK发挥了抗心肌细胞凋亡作用，减少凋亡蛋白的表达。
2．在H/R状态下，U50,488H通过激活AMPK缓解了H/R心肌细胞的线粒体结构损伤，降低了H/R心肌细胞Mito-mPTP开放，减少了线粒体中CytochromeC的释放，使H/R心肌细胞的MMP趋于稳定，同时增加了线粒体生物合成蛋白PGC-1α以及NRF-1的表达。
3．在H/R状态下，U50,488H通过激活κ-OR增加AMPKα和GSK-3β的磷酸化。
第三部分：AMPKα沉默对κ-OR激动剂保护模拟I/R心肌细胞线粒体的影响
1．U50,488H通过激活AMPK缓解H/R心肌细胞的线粒体结构损伤、减少H/R心肌细胞的Mito-mPTP开放以改善线粒体功能障碍，此作用能够被AMPKαsiRNA予以消除。
2．U50,488H通过激活κ-OR增加AMPKα和GSK-3β的磷酸化，这种效应能够被AMPKαsiRNA予以消除。
【研究结论】
1．κ-OR激动剂U50,488H对缺血再灌注心肌的线粒体的结构和功能具有显著的保护作用，具体表现为改善线粒体的结构、增加ATP产量、稳定线粒体膜电位、降低Mito-mPTP开放、减少CytochromeC的释放以及增加了线粒体的生物合成等。
2．κ-OR激动剂U50,488H保护线粒体的作用机制可能与κ-OR介导的AMPK依赖的信号通路有关。至于AMPK的下游信号以及线粒体保护与心肌保护之间的关系等都有待于进一步研究确定。