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β-甘露聚糖酶(endo-1，4-β-D-mannanase；mannohydrolase；EC3．2．1．78)是一类半纤维素酶类，能够水解甘露聚糖中的β-1，4-D-甘露糖苷键，广泛存在与动植物和微生物中。β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸、洗涤、石油开采及生物研究技术等方面得到广泛应用。美国ChemGen公司开发的β-甘露聚糖酶产品“和美酵素”，其售价高达60万元/t。因此，要打破国外公司对国内市场的价格垄断，实现β-甘露聚糖酶的大规模应用，通过基因工程手段表达β-甘露聚糖酶是解决这一问题的有效途径。凝乳酶可以引起蛋白质凝聚，导致牛奶凝结，是奶酪工业化生产的关键酶。凝乳酶主要是从小牛皱胃中获取的，由于乳酪需求不断加大，造成全球小牛短缺使得凝乳酶的来源并不稳定，为了解决这一矛盾，国外相继开展了牛凝乳酶基因工程的研究并获得了良好的经济效益。本研究以糖化酶生产菌株黑曲霉CICC2462为受体菌，针对高表达的糖化酶基因（glaA）位点，构建黑曲霉表达载体pSZH-MAN和融合表达载体pSZH-GCYM，采用农杆菌介导法对黑曲霉进行遗传转化，以期实现目的基因的高效分泌表达，从而为构建安全高效的黑曲霉工程菌奠定了基础。此研究为简化β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶发酵生产工艺，提高β-甘露聚糖酶、牛凝乳酶产量提供了新的途径。主要研究结果如下：1．β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达采用PCR方法，以黑曲霉CICC2462的基因组DNA为模板，克隆得到1275bp的β-甘露聚糖酶基因（MAN），将MAN基因与glaA基因的5’、3’同源臂进行重叠延伸PCR，构建MAN基因的重组表达框GMG。将此表达框插入黑曲霉表达载体pSZH-CYM中，构建黑曲霉重组表达载体pSZH-MAN。将载体pSZH-MAN通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462，经潮霉素筛选和PCR鉴定获得4株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株1株。而后通过连续传代、筛选和PCR检测，获得了纯合的同源重组菌株。对重组菌株进行发酵培养、酶活性检测和SDS-PAGE分析，表明在糖化酶摇瓶发酵条件下，重组菌株培养液上清的β-甘露聚糖酶活性最高可达12467．2U/mL，是出发菌株的72倍，是生产水平的12-15倍。此研究为简化β-甘露聚糖酶发酵生产工艺、提高产量提供了新的途径。2．牛凝乳酶基因在黑曲霉中的表达通过农杆菌介导法将本实验室已构建好的黑曲霉表达载体pSZH-CYM转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株1株。而后通过连续传代、筛选和PCR检测，获得了纯合的同源重组菌株。对重组菌株进行发酵培养、酶活性检测结果表明CYM基因在黑曲霉CICC2462中得到了表达，酶活最高可达960u/mL。为了进一步提高牛凝乳酶基因(CYM)在黑曲霉CICC2462中的表达量，将CYM基因与黑曲霉CICC2462高表达glaA基因进行融合表达。构建黑曲霉重组融合表达载体pSZH-GCYM。将载体pSZH-GCYM通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得4株重组菌株。并从其中筛选出在glaA基因位点发生基因置换的同源重组菌株2株。但尚未检测到酶活。