【摘 要】
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假密环菌(Armillariella tabescens)为白磨科真菌,寄生于树干基部或根部,引起多种树木腐病,菌体可食用。有报道菌丝体可用于治疗急性胆囊炎,慢性胆囊炎急性发作,急性传染
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假密环菌(Armillariella tabescens)为白磨科真菌,寄生于树干基部或根部,引起多种树木腐病,菌体可食用。有报道菌丝体可用于治疗急性胆囊炎,慢性胆囊炎急性发作,急性传染性肝炎,迁延性肝炎,慢性肝炎。其含有的杂多糖组分体外实验证实能抑制小鼠S180肿瘤的生长和增强巨噬细胞的活性,也有报道该菌属的某些种对霉菌毒素(如黄曲霉毒素)有解毒作用。为了深入的研究和开发该菌,本研究利用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的该菌的表达型cDNA文库,为进一步的开发运用做前期准备。 本组应用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的产黄曲霉毒素解毒酶的假密环菌E-20的表达型cDNA文库。从文库中随机挑选150个克隆做5′端测序,得到120条表达序列标签(EST)并将测序结果提交到EMBL数据库。测序结果表明：插入片段长度均在200~800之间,已测通的序列有59条,85条序列3′端有Poly(A)。测序结果经过生物信息学分析,发现有41条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。 利用已获得的序列AJ620046设计基因特异性5端引物,提取E20的总RNA为模板,用5′-RACE技术获得一段401 bp的片段,将此片段与AJ620046拼接后得到长度为1016bp的全长cDNA序列。在全长cDNA序列的基础上,用End to end PCR技术得到了一条完整的开放阅读框的序列AF。运用生物信息学方法分析了AF的核酸、氨基酸序列、蛋白的二级结构和功能预测,超家族分析显示AF属于alpha-L-arabinanase。将PCR扩增获得的AF插入毕赤酵母分泌型载体pHIL-S1中构建重组质粒pHIL-S1-AF,用Sal Ⅰ线性化重组子,通过同源重组整合于毕赤酵母GS115染色体的AOX1区,重组菌株表型为Mut+HIS+,用MM和MD培养基筛选转化子,甲醇诱导表达重组菌,SDS-PAGE测定目的蛋
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