目的 自从1998年Fire等发现RNAi(RNA interferer)现象以来,短短的几年间人们对它的认识和应用速度是惊人的。RNA干扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制,具有高度特异性。21nt干扰性小RNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用,这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新的研究领域,RNAi技术用于人类疾病治疗已受到极大关注,尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究最为活跃,并取得了令人鼓舞的成果。端粒酶在80%～90%的恶性肿瘤中表达,而在大多数正常体细胞不表达,端粒酶是一个通用的人类肿瘤标志。端粒酶在前列腺癌和癌前病变中的高表达,提示端粒酶有可能应用于前列腺癌的诊断,以及端粒酶抑制剂应用于前列腺癌的治疗。本实验探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制肿瘤细胞端粒酶的作用和机理,为肿瘤的基因治疗寻求新的途径。 方法 (1)针对hTERT小干扰RNA分子生成的质粒载体的构建,经酶切电泳及测序分析进行鉴定;(2)重组RNAi质粒转染至ALVA-41前列腺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察前列腺肿瘤细胞端粒酶活性;(3)通过Western-blot检测前列腺肿瘤细胞端粒酶蛋白的表达水平;(4)用细胞记数法观测重组质粒转染对细胞生长的影响。 结果 (1)成功构建重组质粒mU6-hTERT-siRNA,经酶切电泳及测序分析证实,目的序列成功插入到预计位点。(2)结果显示以1745位置为靶位点的siRNA具有相对较好的抑制作用,端粒酶活性有明显的下降。(3)TRAP-PCR电泳结果显示,经RT-PCR扩增后,以12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以此电泳结果可进一步确认TRAP-ELISA检测结果。(4)hTERT-siRNA干扰可以影响ALVA-41细胞的增殖,转染Ⅰ-745质粒抑制ALVA-41细胞的增殖。 结论 (1)成功合成重组RNAi质粒mU6-hTERT-siRNA;(2)应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖;(3)应用以端粒酶